阴山胡枝子种子萌发期的耐盐性及其对盐胁迫的生理响应

赵 露，姜凤琴，苗玉华，张晓宇，刘治国，刘桂霞

(1.河北大学生命科学学院，河北 保定 071002； 2.张家口市林业和草原局草原监理站，河北 张家口 075000； 3.内蒙古赤峰市敖汉旗农牧局，内蒙古 赤峰 024300)

受全球气候变化、人口不断增长的影响，土壤盐碱化程度日趋严重，造成农作物减产；土地盐碱化现象已成为我国农业面临的重要生态环境问题之一[1]。土壤中高浓度的盐会导致植物生理干旱，生长受到抑制，通常表现为植株形态变得矮小，叶片颜色变为暗绿，生长速度变得缓慢，植物的细胞膜透性被破坏，一些与膜结合的酶类活性也被降低，从而引发植物一系列的代谢失调。因此，盐浓度对植物产量和生长影响较大，会影响植物绝大部分的重要生命过程[3]。高盐度会导致植物减产甚至死亡。因此，土壤盐胁迫对植物的危害不容忽视，而研究不同种类不同浓度盐溶液对种子萌发及幼苗生长的影响非常必要。

阴山胡枝子[Lespedezainschanica(Maxim.) Schindl.]为豆科(Leguminosae)胡枝子属(Lespedeza)的落叶小灌木，广泛分布于东北、华北、山西等地，是林缘、山地灌丛的伴生成分，适应性强，耐干旱瘠薄，根系比较发达，是理想的水土保持植物和绿肥作物；营养丰富，是优良的饲用植物[2]。研究表明，阴山胡枝子对NaCl 溶液的胁迫表现出较好的耐受性，耐盐半致死浓度为1.0%[3]，而对Na2CO3和复盐胁迫下阴山胡枝子的耐受性未见报道。本试验采用3种不同盐分处理阴山胡枝子种子，测定萌发期的萌发指标和生理指标，以期为阴山胡枝子在不同盐碱地环境下的育苗与开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

选用2018年采自河北省张家口市沽源县的阴山胡枝子种子，室内进行干燥和清选，去除果皮，4 ℃冰箱中贮存，2019年3月进行试验。

1.2 试验设计与方法

本试验设置了Na2CO3、NaCl、复盐(50%NaCl、30%Na2SO4、10%NaHCO3、10%Na2CO3)等3种盐溶液，每种盐分别设置0.3%、0.6%、0.9%等3种浓度，以清水为对照，共10个处理，每处理4次重复。阴山胡枝子种子的萌发采用培养皿滤纸法培养。首先称取适量的种子放入80 ℃水中泡30 min。然后从中挑取饱满、未萌发的种子放于75%酒精中消毒10 min，再用无离子水洗净，最后在铺有双层滤纸、已加目标浓度的盐溶液的培养皿中放置50粒种子，放入(25±5)℃恒温培养箱中培养，每天定时补充溶液，并从点种第2天就开始每天定时观察和记录种子的发芽数量，到种子萌发状态稳定时(28 d)计算发芽率。

在种子萌发稳定期取样测定阴山胡枝子抗氧化酶活性(超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT))、可溶性蛋白含量等数据，在种子萌发结束后取样测定相对叶绿素含量和胚根的长度等数据。

1.3 测定指标

盐碱害指数(%)=[(对照种子的发芽率-处理种子的发芽率)/对照发芽率]×100%。

耐盐碱级别评价方法为，通过公式计算盐碱害指数，确定耐盐碱级别，其中盐碱害指数为0～20.00%，耐盐碱级别为1级；盐碱害指数为20.10%～40.00%，耐盐碱级别为2级；盐碱害指数为40.10%～60.00%，耐盐碱级别为3级；盐碱害指数为60.10%～80.00%，耐盐碱级别为4级；盐碱害指数为80.10%～100.00%，耐盐碱级别为5级[4]。

耐盐指数=(平均相对发芽率+平均胚根长度+相对发芽势)/3[5]；

发芽率(%)=(处理种子的发芽率/供试种子数)×100%[6]；

发芽势(%)=(发芽种子数高峰日正常发芽种子数/供试种子数)×100%；

胚根长(cm)：萌发10 d后每种处理各取10株幼苗用刻度尺测量其胚根长度，并计算平均值。

相对叶绿素含量(SPAD)：试验结束后每种处理各取5株阴山胡枝子幼苗，用SPAD-502 Plus便携式叶绿素测定仪测定其相对叶绿素含量，计算平均值。

抗氧化酶活性：本试验测定采用氮蓝四唑(NBT)法超氧化物歧化酶的活性、愈创木酚法测定过氧化物酶的活性和紫外吸光光度法测定过氧化氢酶活性[7]。

可溶性蛋白含量：应用考马斯亮蓝(G-250)染色法[8]。

1.4 数据分析

试验所得数据均用Microsoft Excel软件进行记录，并依据相对应公式计算，计算结果运用SPSS 20.0软件进行单因素方差分析，使用Duncan检验进行不同处理间显著性分析，结果用平均值±标准误表示，最后使用Microsoft Excel软件作图。

2 试验结果

2.1 盐胁迫对阴山胡枝子种子发芽率的影响

3种盐胁迫都对阴山胡枝子种子的发芽率产生了显著影响(p<0.05)。由图1可知，随着盐胁迫浓度的增加，3种盐处理的发芽率均呈显著降低的趋势；同一浓度不同盐溶液胁迫下发芽率也有显著差异。当浓度为0.3%时，Na2CO3、NaCl、复盐处理的发芽率均较对照显著降低，分别降低了30.4%，16.9%和18.6%；NaCl和复盐处理的发芽率差异不显著，但均显著高于Na2CO3处理的发芽率；当浓度为0.6%时，Na2CO3和复盐处理的发芽率降低幅度大，分别较对照降低了82.9%和75.8%；NaCl处理的降低幅度较小，降低了30.7%；当浓度为0.9%时，各盐分处理之间差异显著，NaCl和复盐处理的显著高于Na2CO3处理的发芽率，但两者之间差异不显著。

注：大写字母代表同种盐溶液，不同浓度处理之间的差异显著； 小写字母代表相同浓度不同盐溶液处理之间的差异显著。下同。图1 盐胁迫对阴山胡枝子种子发芽率的影响

2.2 盐胁迫对阴山胡枝子种子胚根长的影响

盐胁迫显著影响了阴山胡枝子的胚根长(p<0.01)。由图2可知，Na2CO3溶液、NaCl溶液和复盐溶液处理的阴山胡枝子胚根长度均随浓度增加而显著降低，与对照相比，下降幅度为28.7%～76.7%。同一浓度下不同盐处理胚根长由高到低的顺序均为NaCl>复盐>Na2CO3；NaCl溶液处理对胚根长的抑制作用弱于Na2CO3和复盐。

图2 盐胁迫对阴山胡枝子幼苗胚根长度的影响

2.3 盐胁迫对阴山胡枝子种子相对叶绿素含量的影响

由图3可知，随着浓度的增加，各种盐溶液处理的阴山胡枝子幼苗的相对叶绿素含量均显著降低，且在0.3%浓度后相对叶绿素含量基本不变。同一浓度下，不同盐溶液处理之间的阴山胡枝子相对叶绿素含量差异不显著。

图3 盐胁迫对阴山胡枝子幼苗相对叶绿素含量的影响

2.4 盐胁迫对阴山胡枝子种子抗氧化酶活性的影响

2.4.1SOD活性

盐胁迫显著影响了阴山胡枝子种子萌发期的SOD活性(p<0.05)。由图4可知，除Na2CO30.3%浓度处理显著高于对照、复盐0.9%浓度处理与对照差异不显著外，3种盐溶液处理的阴山胡枝子萌发期种子的SOD活性均较对照显著降低。Na2CO3胁迫下，随着浓度的增加，阴山胡枝子的SOD活性呈先上升后下降的趋势。

2.4.2POD活性

盐胁迫显著影响了阴山胡枝子种子萌发期POD活性(p<0.01)。由图5可知，Na2CO3、NaCl、复盐溶液处理的阴山胡枝子种子的POD活性均随盐溶液浓度增加而显著降低，对照组与各浓度处理之间，以及各浓度处理之间的POD活性均有显著差异。同一浓度下，不同盐分之间也有显著差异，复盐的抑制作用更强，POD活性在0.3%和0.6%浓度处理下显著低于其它2种盐溶液处理的POD活性。

图4 盐胁迫对阴山胡枝子SOD活性的影响

图5 盐胁迫对阴山胡枝子POD活性的影响

2.4.3CAT活性

盐胁迫显著影响了阴山胡枝子种子萌发期的CAT活性(p<0.05)。由图6可知，除Na2CO30.3%浓度处理显著高于对照外，3种盐溶液处理的阴山胡枝子萌发期种子的CAT活性均显著低于对照。Na2CO3溶液处理的阴山胡枝子种子的CAT活性随浓度升高呈先升高后降低的趋势，当浓度为0.3%时，阴山胡枝子的CAT活性最高；当浓度为0.6%时，CAT活性最低。复盐溶液处理的阴山胡枝子种子CAT活性随浓度升高呈先下降后上升的趋势；当浓度为0.3%时，CAT活性最低，当浓度从0.6%到0.9%时，CAT活性逐渐上升，但仍低于对照组的CAT活性。同一浓度处理下，3种盐胁迫处理之间的差异均显著，阴山胡枝子种子的CAT活性最低的均为NaCl溶液。

2.5 可溶性蛋白含量

盐胁迫显著影响了阴山胡枝子的可溶性蛋白含量(p<0.01)。由图7可知，随着盐溶液浓度的增加，可溶性蛋白含量增加；0.3%的Na2CO3溶液处理的阴山胡枝子种子可溶性蛋白含量低于对照组处理，但差异不显著。3种盐溶液均对种子的可溶性蛋白含量有促进作用。复盐在浓度为0.3%时，可溶性蛋白含量最高，较对照提高了70.6%；Na2CO3和NaCl在0.9%浓度下可溶性含量最高，分别较对照提高了143.1%和157.1%。Na2CO3溶液处理的阴山胡枝子种子可溶性蛋白含量随浓度升高先降低后升高；NaCl溶液处理的阴山胡枝子种子的可溶性蛋白含量随浓度升高而升高。

图6 盐胁迫对阴山胡枝子CAT活性的影响

图7 盐胁迫对阴山胡枝子可溶性蛋白含量的影响

2.6 盐胁迫下阴山胡枝子的耐盐性

从表1可知，同种盐胁迫下阴山胡枝子的耐盐指数之随浓度升高而下降；Na2CO3和复盐在0.3%～0.6%浓度间减幅较大；从耐盐指数和盐碱害指数综合看，阴山胡枝子对NaCl和复盐胁迫在0.3%浓度下均表现出高耐受性；0.6%浓度下，对NaCl表现出耐受性；0.6%及更高浓度下，对复盐胁迫表现为中敏和敏感，对Na2CO3表现为敏感。

表1 盐胁迫下阴山胡枝子的耐盐性

3 讨论与结论

3.1 讨 论

阴山胡枝子种子的发芽率、胚根的长度可直接反映其生长情况。发芽率是种子活力的重要指标。不同种类的盐溶液对阴山胡枝子种子发芽率存在显著的抑制作用， NaCl处理的降低幅度相对较小，Na2CO3处理和复盐处理的抑制作用强于NaCl处理，其中抑制阴山胡枝子种子发芽率程度最强的是Na2CO3溶液。说明阴山胡枝子对NaCl胁迫的耐受性较强，这与张桂荣等[3]的研究结果相似，他们研究发现，阴山胡枝子在0.4% NaCl溶液胁迫下发芽率为86%，表现出较好的耐受性。但本试验同时说明，同种植物对不同的盐胁迫的耐受性不同；盐胁迫对胚根生长的抑制作用与发芽率类似的趋势，3种盐的胁迫也是Na2CO3处理和复盐处理的抑制作用强于NaCl处理。

叶绿素也是对盐胁迫最敏感的细胞器，其含量直接影响植物的生长发育[9]。孟富宣等研究发现，盐胁迫达到一定浓度后降低了叶绿素含量，进而使光合速率下降[10]。3种盐溶液处理阴山胡枝子后，幼苗的相对叶绿素含量均显著降低,说明盐胁迫会通过降低叶绿素含量进而抑制植物生长。

SOD活性下降说明植物体内的超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢等不断产生，促使阴山胡枝子幼苗启动了相应的适应性反应，但随着盐浓度增加和胁迫继续加深，活性氧的积累超出了阴山胡枝子幼苗的抗氧化酶系统可能清除的范围，从而整个抗氧化酶系统功能降低，这与孟富宣等[10]、李龙兴等[16]的研究结果一致。0.3%Na2CO3胁迫时，SOD活性和CAT活性相应增强，可能是碱性盐(Na2CO3)对阴山胡枝子种子萌发抑制较强，使得SOD活性升高以清除体内胁迫产生的超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢等，进而减轻对细胞的伤害。

可溶性蛋白质大部分是与植物的新陈代谢活动相关的酶类，因此其含量能反映出植物组织的代谢能力[17]。本试验表明，Na2CO3、NaCl和复盐胁迫时阴山胡枝子可溶性蛋白均随胁迫浓度增加而显著增加，说明盐胁迫诱导细胞合成了新的蛋白质，阴山胡枝子靠增加新抗性蛋白合成提高蛋白含量改变胞内渗透势，而0.3%Na2CO3胁迫时，可能阴山胡枝子种子通过抑制蛋白合成、加速储藏蛋白水解提高抗盐性，所以在不同盐胁迫时有不同反应机制。盐胁迫时，可溶性蛋白含量显著上升，既能以合成抗氧化酶方式保持细胞抗氧化系统稳定[16]，也能以结构物质的形式参与细结构伤害的修复过程[18]。随着胁迫浓度的增加,抗氧化酶含量升高，但盐浓度达到一定高度后，随着胁迫时间的延长，抗氧化酶活性降低，酶系统受损，可溶性蛋白调节作用变小，增加的脯氨酸的渗透调节作用不足以应对盐胁迫，细胞受损甚至危及植物生命[10,16]。

阴山胡枝子酶活性的变化与耐盐等级和耐盐指数表现的耐盐性相符合，说明阴山胡枝子对中性盐(NaCl)的耐受性较强，对碱性盐和复盐较敏感；盐胁迫下，通过应激反应合成新的蛋白质，参与抗氧化酶和细胞结构修复以降低或减少对细胞的伤害，但这种调节能力在高盐分胁迫时可能超出了其可能清除的范围，整个抗氧化酶系统功能降低，这与发芽率和胚根长等的耐盐性指标相符。

3.2 结 论

3种盐处理的发芽率、胚根长均随浓度升高而显著降低，NaCl溶液处理对发芽率、胚根长的抑制作用弱于Na2CO3和复盐，0.6%的NaCl处理较对照降低了30.7%。各种盐溶液处理的阴山胡枝子幼苗的相对叶绿素含量均显著低于对照。

除Na2CO30.3%浓度显著高于对照外，3种盐溶液处理的阴山胡枝子萌发期种子的SOD和CAT活性均较对照显著降低。同一浓度处理下，阴山胡枝子种子的CAT活性最低的均为NaCl溶液。POD活性均随盐溶液浓度增加而显著降低。复盐的抑制作用更强，POD活性在0.3%和0.6%浓度下显著低于其它2种盐溶液的POD活性。

随着盐溶液浓度的增加，可溶性蛋白含量增加；3种溶液均对种子的可溶性蛋白含量有促进作用。Na2CO3溶液处理的阴山胡枝子种子可溶性蛋白含量随浓度升高先降低后升高；NaCl溶液处理的阴山胡枝子种子的可溶性蛋白含量随浓度升高而升高。

从耐盐指数和盐碱害指数综合看，阴山胡枝子对Na2CO3和复盐胁迫在0.3%浓度下均表现出高耐受性；0.3%和0.6%浓度下，对NaCl表现出高耐受性和耐受性；0.6%及更高浓度下，对复盐胁迫表现为中敏和敏感，对Na2CO3表现为敏感。

因此，阴山胡枝子有一定的耐盐性和相应的耐盐机制，对0.6%NaCl、0.3% Na2CO3和复盐有一定的抗性，阴山胡枝子可以在适宜浓度的盐碱地种植。