神农架豆豉样品中微生物的分离鉴定

张坤煜，赵舒欣，王红丁，贺蓓蓓,宋园亮

(湖北医药学院，湖北 十堰 442000 )

1 引言

豆豉是以黄豆或黑豆为主要原料，经霉菌或细菌等微生物发酵而成，它是我国一种传统的大豆发酵食品，根据地域特点、地理气候、饮食文化，不同地方又有不同的特色[1～3]。位于湖北省西北部的神农架自然保护区，其特殊的地理环境和气候条件孕育了十分丰富的生物资源。神农架林区居住民族有10个，以汉族为主，林区部分居民有制作和食用大豆发酵食品的习惯，神农架豆豉是一种以大豆为主要原料，佐以花椒、生姜、大蒜和辣椒制成的一种传统发酵食品，有开胃生津、消积化滞、驱风散寒等功效，是神农架地区一种独特风味佐餐食品。

目前，国内对神农架豆豉微生物种类鲜有报道，本研究从神农架林区采集的传统发酵豆豉样品中分离微生物[4～7]，旨在了解该地区豆豉中微生物的种类及菌群分布情况，初步构建神农架林区微生物菌种库，从中选育优良菌株，为神农架豆豉的工业化发展做出贡献。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

2.1.1 实验材料

神农架豆豉样品购于湖北省神农架林区松柏镇集贸市场。

2.1.2 试剂

革兰氏染色液试剂盒(Solarbio G1060)、香柏油(国药集团化学试剂有限公司)、细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN DP302)、通用引物16S rDNA 27f和16S rDNA 1492r(Genscript)、10000×SolarGelRed核酸染料、2×Taq PCR MasterMix、M5 DL2000 DNA Marker MF025-01、琼脂粉(杭州天和微生物试剂有限公司)。

2.1.3 培养基

MRS培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司)、MRS肉汤培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司)。

2.1.4 仪器与设备

NewClassic MF MS304S电子分析天平(梅特勒-托利多集团)、HCB-1300V垂直层流洁净工作台(Haier)、DHG-9243BS电热恒温鼓风干燥箱(上海新苗医疗器械制造有限公司)、THZ-82B气浴恒温振荡器(常州市国旺仪器制造有限公司)、MLS-3781L高压灭菌器(Panasonic公司)、SPH-2102C新颖立式小容量恒温摇床(上海世平实验设备有限公司)、BIO-RAD C1000 Touch PCR仪(美国伯乐公司)、Eppendorf Centrifuge 5424R小型冷冻高速离心机(德国艾本德股份公司)、OLYMPUS BX53显微镜、BIO-RAD Universal Hood Ⅱ凝胶成像分析仪(美国伯乐公司)、MK-2O干式恒温器(杭州奥盛仪器有限公司)。

2.2 试验方法

2.2.1 神农架豆豉样品中微生物的分离

采用浓度梯度稀释法分离豆豉样品中的微生物。取1 g神农架豆豉样品于试管中，加入9 mL 0.9% 灭菌生理盐水，取灭菌的玻璃棒捣碎样品并摇匀，静置30 min。从试管中取1 mL 液体加入 9 mL 0.9% 灭菌生理盐水中，以此类推，配制成8个稀释浓度。

2.2.2 神农架豆豉样品中微生物的纯化

取稀释浓度为 10-8～10-4的样品各100 μL，用玻璃三角涂布棒均匀涂布在MRS培养基平板上，直至干燥。置于37 ℃恒温培养箱内，倒置培养24 h。选取形态不同的单菌落共7个，挑取菌落，采用平板划线法纯化菌株并进行编号[8～10]，分别编号为SN1-1、SN1-2、SN1-3、SN1-4、SN1-5、SN1-6、SN1-7。

37 ℃倒置培养24 h后，在超净台内，每个平板上选取1个生长情况较好的单菌落，分别用镊子夹取灭菌200 μL枪头挑取菌落，放入有3 mL MRS肉汤培养基的离心管中。另取一只离心管加入3 mL MRS肉汤培养基、灭菌200 μL枪头做空白对照，8只离心管恒温摇床37 ℃ 150 r/min震荡过夜。

2.2.3 菌株的革兰氏染色

2.2.3.1 菌株革兰氏染色

标号为SN1-1、SN1-3、SN1-4、SN1-5出现明显浑浊。取4块载玻片做好正反面标记，分别取1环菌液滴在载玻片中央，在酒精灯火焰上方烘干，并在火焰中来回1～2次固定。加结晶紫染色1 min，水洗；加碘液染色1 min，水洗；加95%酒精，脱色30 s，水洗，吸去水分；加蕃红染色1 min，水洗，晾干。

2.2.3.2 菌株革兰氏染色镜检

滴1滴香柏油，油镜镜检。

2.2.4 菌株的DNA鉴定

使用细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)提取四株菌株的基因组DNA。PCR扩增采用16S rDNA 通用引物，正向引物27f序列为 5＇-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3＇，反向引物1492r 序列为5＇-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T - 3＇，扩增长度为1500 bp 左右，聚合酶链式反应( PCR) 扩增体系见表1。

表1 PCR扩增体系(20 μL)

PCR反应条件：95 ℃预变性 3 min;95 ℃变性30 s，56 ℃ 退火 30 s，72 ℃ 延伸 2 min，此阶段循环30次，72 ℃ 延伸 5 min，扩增产物4 ℃ 保存。

SN1-1、SN1-3、SN1-4、SN1-5扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

2.2.5 构建系统发育树

将获得的SN1-1、SN1-3、SN1-4、SN1-5菌株的16S rDNA序列在NCBI网站上用BLAST序列对比程序中的Nucleotide BLAST在数据库中进行比较，分析同源性，选取8个与菌株同源较高的16S rDNA 序列构建系统发育树。采用MEGA5.0软件[11],以Neighbor-joining法绘制16S rDNA系统发育树[12，13]。

3 结果与分析

3.1 菌株的革兰氏染色

镜检照片如图1，革兰氏染色结果及形态见表2。

表2 从神农架豆豉样品中分离得到的四株菌的革兰氏染色结果及形态

图1 革兰氏染色镜检照片(图中右下角标尺均为50 μm，目镜10倍，物镜100倍)

所分离的4株菌株均为革兰氏阳性菌，成链形，形状为棒状或杆状。

3.2 菌株的DNA鉴定

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，琼脂糖凝胶电泳成像见图2。

图2 琼脂糖凝胶电泳成像

SN1-1、SN1-3、SN1-4、SN1-5扩增产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序，通过序列结果拼接，得到SN1-1菌株16S rDNA 序列长度为1455bp，SN1-3、SN1-4、SN1-5菌株16S rDNA 序列长度均为1451bp。

3.3 菌株的系统发育树

将SN1-1、SN1-3、SN1-4、SN1-5菌株的DNA序列与GenBank 数据库中的序列进行比对分析，采用MEGA5.0软件，以Neighbor-joining法绘制的16S rDNA系统发育树[14～17]如图3～6。

据图3～6分析可知，菌株SN1-1、SN1-3、SN1-4、SN1-5与芽孢杆菌(Bacillus sp.)系统位置最近。根据16SrDNA序列同源性比对和系统发育树的构建，可以得到菌株SN1-1、SN1-3、SN1-4、SN1-5属于细菌范畴，为芽孢杆菌属，是枯草芽孢杆菌属的亚种。

图4 利用16SrDNA序列对SN1-3菌株进行构建系统发育树

图5 利用16SrDNA序列对SN1-4菌株进行构建系统发育树

图6 利用16SrDNA序列对SN1-5菌株进行构建系统发育树

4 讨论

神农架属大巴山脉东延之余脉，地势由南向北，由西向东逐渐降低，形成了典型的垂直生态系统和植被类型。神农架地区属亚热带季风气候，主要受亚热带季风气候的影响，温度适宜，降水丰沛。其特殊的地理位置和气候环境造成了独特的微生物种群。神农架林区豆豉的微生物资源丰富，由于人们对其营养价值认识不足，食用人群相对偏少，目前还未有学者对神农架豆豉中微生物开展研究。本研究以神农架林区豆豉为研究对象，采用传统分离培养方法和分子鉴定方法相结合，对分离的神农架豆豉中的细菌进行鉴定。相比较传统的生理生化鉴定，具有简洁快速、准确性高的优点。

本研究从神农架林区3个豆豉样品中分离筛选出了4株菌株，并对其进行了形态学和分子生物学鉴定，将其鉴定为枯草芽孢杆菌。枯草芽孢杆菌是细菌型豆豉发酵的主要微生物，因其具有丰富的酶系，能分泌产生蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等十几种酶，与豆豉风味、品质、色泽等密切相关。对于神农架林区细菌型豆豉优势菌株的筛选与鉴定，本试验采集了3个豆豉样品，未分离出乳酸菌，且分子鉴定数量相对较少。下一步，将采集较多的豆豉样品，进行微生物多样性鉴定，探究神农架林区豆豉的种类组成，并将筛选的优势菌株进行纯菌种发酵研究，进而为神农架豆豉工业化、标准化生产提供参考。