对单个卵子不同授精方式的妊娠结局分析*

张秀冰, 施高慧, 陈明晖, 丁晨晖, 蔡炳, 陆宝敏, 刘瑜亮, 徐艳文

中山大学附属第一医院妇产科生殖中心(广东广州 510080)

随着中国二胎时代的到来，越来越多的不孕患者为高年龄女性(产科定义为年龄≥35岁)，需寻求辅助生殖技术。高龄妇女卵巢储备功能明显下降，获得卵子数少，受精率较低[1],周期取消率高[2]，如何提高卵巢反应不良患者的卵子利用率，获得可利用胚胎是目前临床关注的热点问题，而卵子授精方式的选择是其关键点。目前体外授精的方式有常规体外授精(IVF)和单精子卵胞浆内显微注射(ICSI)两种。1992年世界首例ICSI成功应用于男方因素不育[3]。之后有报道指出ICSI不但对于男性因素，也可用于前次受精率低的不孕患者，而且还能降低多精受精率[4-5]，并且ICSI的运用指征越来越广泛[6]。然而与常规IVF相比，ICSI是否能提高胚胎质量、胚胎种植以及获得更好的临床结局，尚无定论[7-8]，特别是对卵子数量极少的患者，运用哪种方式授精更适合,目前尚有争议[9-10]。因此，本研究回顾性分析仅获得单个卵子的取卵周期在不同授精方式下的各项胚胎参数和临床结局，为临床选择授精方式提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 回顾性分析2012年9月至2016年11月在中山大学附属第一医院生殖中心接受治疗，每周期只获得单个卵子并通过IVF或ICSI授精的525例患者共777个周期。根据精液质量情况将其分为3组：IVF组(n=563)，严重男方因素(severe male factor, SMF)-ICSI组(n=151)和非严重男方因素(non-severe male factor， NSMF)-ICSI组(n=63)。不孕病因包括：卵巢功能衰退、盆腔及输卵管因素、子宫内膜异位症、不明原因不孕、排卵障碍、男方少弱畸精症等。本研究已通过我院临床科研和实验动物伦理委员会批准，已签知情同意。

1.2 控制性促排卵方案 根据患者本身的卵巢储备情况选择不同的促排卵方案，启动剂量根据患者的年龄，基础卵泡刺激素水平，基础窦卵泡数等决定。阴道超声和激素水平监测卵泡发育，当1个主导卵泡直径≥18 mm或2个优势卵泡直径≥17 mm 时，肌内注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)10 000 U。34～36 h后超声引导下取卵。

1.3 精液处理 患者取卵当天，丈夫通过手淫取精并将精液放置到无菌的取精杯中，根据WHO第5版精液处理方法，IVF精液处理为梯度离心加上游法，授精浓度调为1×106·mL-1。ICSI精液处理为上游法。

1.4 ICSI的适应证 3次检查内至少有2次以上精液常规符合以下任一标准者：(1)重度少精子症，两次检查精液密度<5×106·mL-1；(2)重度弱精症，精液密度>15×106·mL-1，向前运动精子率<5%；(3)重度畸精症，精子正常形态率<1%；(4)精子顶体反应率<5%；(5)一次射精的活动精子总数<1.5×106·mL-1；(6)处理后的精液密度<1×106·mL-1；(7)前次IVF受精率<30%或完全受精失败；(8)冷冻精子后解冻复苏为少弱精子。NSMF组的精液常规分析：处理后的精液密度<1×106·mL-1；前次IVF受精率<30%或完全受精失败；反复IVF失败；冷冻精子后解冻复苏为少弱精子。SMF组精液常规分析：重度少精子症；重度弱精症；重度畸精症；精子顶体反应率<5%；一次射精的活动精子总数<1.5×106条。

1.5 受精观察及胚胎评分 IVF授精时间为取卵后4～6 h，ICSI为取卵后2～4 h，16～20 h后观察受精情况，观察到两个原核(2PN)和两个极体为正常受精。受精后D3进行卵裂期胚胎评分，根据SART评分标准:细胞数量、对称性、碎片比例3个指标来评估胚胎的优劣。

可移植胚胎为4细胞或4细胞以上，卵裂球大小均一或中度不均，碎片为<25%；优质胚胎为6～9细胞，卵裂球大小均一或中度不均，碎片为≤10%。第5～6天囊胚的评分根据Gardner评分方法进行，从囊胚的扩张状态，内细胞团和外滋养外胚层的发育对囊胚进行评估。可移植的胚胎为3BB及以上囊胚，优质囊胚为第5～6天囊胚评分为3～6期,内细胞团和外滋养评分在BB或BB以上(3BB/3AA/4BB/4AA/5BB/5AA/6BB/6AA)。

1.6 各项观察指标 成熟卵子率(MⅡ)、正常受精率(2PN) 、异常受精率(MPN)、卵子退化率、可利用胚胎率、优质胚胎率、每周期临床妊娠率。

1.7 玻璃化冷冻及解冻方法 D3卵裂期胚胎和囊胚的玻璃化冷冻：采用玻璃化冷冻试剂盒(Kitazator,日本),操作按说明书进行，具体的过程参照Kuwayama 等的方法。复苏胚胎时将胚胎从液氮中迅速取出并放入含有1 mol/L蔗糖的(1)液(37℃)中平衡1 min，再转入含0.5 mol/L 蔗糖(2)液中平衡3 min,之后移入含0.25 mol/L蔗糖的(3)平衡液中平衡3 min，再转入无含蔗糖平衡液(4)平衡3 min，最后再重复移入另一无含蔗糖平衡液(4)中3 min。

1.8 临床妊娠指标 观察新鲜周期移植为取卵后的第3天或第5～6天进行胚胎移植，常规的黄体支持。解冻周期在是自然周期(NC)或人工替代周期(HRT)，移植后12～14 d检测尿的HCG和血的HCG水平，阳性者为生化妊娠。6～7周下B超下观察到有孕囊为临床妊娠。

1.9 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析,多组资料均数比较采用方差分析,各种率的比较采用2检验，P<0.05为差异有统计学意义。当P<0.05差异有统计学意义时，采用Bonferroni校正法进行3组样本间两两比较，P=0.016 7。

2 结果

2.1 3组基本资料比较 3组的基本情况如表1所示，3组的年龄、体质指数(BMI)、不孕年限、基础FSH、卵泡总数差异无统计学意义(P>0.05)。总周期数(即包括在外院和本院进行的促排周期总和)的差异有统计学意义(P<0.05)，NSMF-ICSI组的平均总周期数为5.6±4.5，明显高于IVF组(3.2±2.7)和SMF-ICSI组(3.2±2.1)。

表1 患者的基本资料比较

2.2 3组胚胎发育及妊娠结局比较 本研究仅纳入在本院进行的促排周期777个。3组间IVF组卵子成熟率(MⅡ)为94.8%，显著高于ICSI-SMF组的85.4%和NSMF-ICSI组90.5%，差异有统计学意义(P<0.05)；进一步对3组数据进行两两比较，IVF组卵子成熟率显著高于ICSI-SMF组，P=0.00<0.016 7。SMF-ICSI组(81.4%)和NSMF-ICSI(80.7%)组的正常受精率高于IVF组(70.3%)，差异有统计学意义(P<0.05)；进一步对3组数据进行两两比较，SMF-ICSI组的正常受精率显著高于IVF组，P=0.01<0.016 7。3组之间的1PN率、MPN率、可利用胚胎率、优质胚胎率、每周期妊娠率差异均无统计学意义(P>0.05)。IVF组卵子的自然退化率为1.4%；SMF-ICSI组和NSMF-ICSI组由机械损伤造成的卵子退化率分别为4.7%和3.5%, ICSI操作造成的卵子退化率更高，差异有统计学意义(P<0.05)；进一步对3组数据进行两两比较，各组之间差异无统计学意义(P>0.016 7)。

另外，3组中新鲜移植周期加冷冻周期例数分别为IVF：48+48个周期、SMF-ICSI：8+16个周期、NSMF-ICSI：6+3个周期。IVF组的每周期临床妊娠率为19.8%，SMF-ICSI为12.5%,NSMF-ICSI为11.1%，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 胚胎发育及妊娠结局 %

3 讨论

ICSI的运用使其获得正常受精卵是体外授精成功的关键。一般体外授精方式有常规IVF和ICSI两种。ICSI主要用于男性因素的不孕症，但在国外也运用于非男方因素的不孕症。在朱家红等[11]的研究中指出高龄非男性因素不孕患者治疗周期中，ICSI不能改善胚胎质量和临床结局。Kim等[7]的研究认为，ICSI能提高反复种植失败的非男性因素不孕患者的正常受精率和胚胎质量，但最终不能改变低临床妊娠率的结局。该研究的学者认为可能与患者的反复种植失败、子宫内膜容受性、女方年龄大、胚胎移植时间的选择等复杂因素相关。

由于担心获卵数极少时进行常规IVF，可能会受精失败或者多精受精，导致珍贵卵子不能形成可利用胚胎，有中心倾向于选择ICSI以提高受精的比例和卵子利用率。在使用ICSI时，需考虑以下几个因素：(1)显微操作的干预，可能造成卵子退化；(2)卵子可能在操作时并未处于最佳成熟状态，而过夜的常规IVF中卵子在体外成熟后更能通过自然选择而获得高质量的受精卵；(3)ICSI跨越自然受精的全部障碍，可能存在安全隐患，如聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)的使用，可能会对卵子和胚胎造成负面影响[12]，但目前关于对子代安全方面的研究中，无论哪种授精方式，子代的出生缺陷[13]和精神运动发育[14]都相似的结果；(4)相对于IVF技术，进行ICSI技术所需要的人力、物力和经费更多。在我们的研究中ICSI组没有降低卵子的多精受精率，3组的多精受精率差异无统计学意义 (P>0.05)；ICSI组中的卵子退化率更高，3组的卵子退化率差异有统计学意义(P<0.05)。因此，在极少卵的患者中应用ICSI技术时应权衡利弊和个体原因，慎重选择。

仅获得单个卵子周期的研究中，Gozlan和Ioannis等[15-16]先后报道通过ICSI不能提高非男性因素不育患者的受精率和胚胎质量。郭新宇等[17]的研究也表明无明确男性因素的卵巢低反应周期，行ICSI治疗并未提高其受精率。另外，有研究认为胚胎的质量最主要取决于配子本身的内在因素，与授精方式无关[18]。本研究也表明ICSI能提高严重男性因素和非严重男性因素的正常受精率，但不能提高胚胎利用率、优质胚胎率，不能改善低临床妊娠率的结局。这可能与女方年龄较大、卵子的质量较差、子宫内膜容受性差等因素相关。因此支持单个卵的授精方式仍应由是否有男方因素来决定的观点。

本研究中，NSMF-ICSI组进行ICSI的原因分析如下： NSMF-ICSI组(男方精液无明显异常或仅有一项参数稍弱)的63个周期中，前一周期IVF完全受精失败有26个周期(41.3%)，前次IVF受精率低于30%有5个周期(7.9%)，异常受精 4个周期(6.3%)，故本周期改用ICSI授精。剩余28个周期(44.4%)均为精液参数有一项或多项异常，未达到严重少弱精标准，但由于精液处理后回收量极低，处理后的精液密度<1×106·mL-1，未达IVF标准。常规IVF周期引起完全受精失败与低受精率的因素包括精子与卵子的质量，受精过程及体外环境等，目前尚无明确方法预防受精失败的发生，因此在NSMF-ICSI组中前一周期完全受精失败或低受精率共31个周期(占49.2%)，是导致该组总周期数高于其它两组的最主要原因。

本研究中ICSI组的多精受精率与IVF组比较，差异无统计学意义。大多数的报道研究认为：常规IVF多PN率为5%～8.1%，ICSI是2.5%～6.2%，在本研究中IVF多PN率为14.2%，高于大多文献报道。多精受精的原因可能与卵子的成熟度、授精精子密度、皮质反应、卵子募集过程中造成的透明带损伤或先天透明带缺陷、卵泡液中高激素水平相关，少量患者的某些周期中可见高比例的多原核合子。我们的研究中3组的年龄均为38岁以上，均为高龄女性，卵子过熟或不熟可能是其主要原因。 ICSI周期的MPN率分别为18.6%、12.3%，并没有降低多精受精率，其原因可能包括：首先，卵母细胞第二极体未能排出或排出“假第二极体”(不含遗传物质)致使形成两个雌原核；其次，注入二倍体的精子；再次，卵子本身为多倍体异常，高龄妇女卵母细胞内线粒体长度变短和端粒酶活性下降影响同源染色体联会、减数分裂最后导致卵母细胞非整倍体率相应增加，引起多倍体胚胎发生率增高；最后，ICSI的操作时可能损伤了赤道板区域引起染色体不能正常分离而出现多PN受精。

综上所述，通过ICSI授精方式能提高严重男性因素和非严重男性因素的单个卵子的正常受精率，但不能降低多精受精率，也不能提高可利用胚胎率、优质胚胎率，并且不能改善低周期临床妊娠率的结局。因此，此类患者选择哪种授精方式应根据男方精液质量结合临床的不孕史进行授精方式的选择。由于本研究的样本量少，尚需要多中心多样本前瞻随机对照研究来追踪目前所证实的结果。