副干酪乳杆菌固态发酵对红枣碎活性成分和抑菌性影响

魏嘉雯,王海宽,张惠玲,*

(1.宁夏大学农学院,宁夏银川 750000; 2.天津科技大学生物工程学院,天津 300457)

红枣(ZizyphusjujubaMill.)是鼠李科枣属果实,在我国有悠久的种植历史[1]。红枣中含有的多酚、三萜、环磷酸腺苷、VC等功能性成分具有抗氧化、抗过敏、抗衰老等多种生理功能,因此被视为“上等补品[2]。近年来以红枣为原料开发乳酸菌发酵饮品的研究逐渐增加,张丽华等[3]发现用益生菌发酵红枣可以在保留原有风味同时提高红枣抗氧化能力;李冰[4]用乳酸菌混合发酵红枣和麸皮,制得一种有良好肠道益生功能的红枣功能性饮料。

副干酪乳杆菌是一种广泛存在于发酵乳制品及人体肠道中的兼性厌氧微生物[5],有良好的调节肠道菌群、改善结肠炎症状和增强免疫力的功能[6-7]。用副干酪乳杆菌发酵果蔬产品,不仅能保留原有营养价值,还能提高有机酸、细菌素、多糖和GABA等多种活性成分含量。多糖是一种天然高分子化合物,可以提高机体免疫力和抗氧化力,是良好的生物活性物质[8];王若瑾等[9]用乳酸菌发酵豆乳,发酵后多糖含量增加了77.12%。GABA是一种新型的功能因子,有改善情绪、缓解压力、促进睡眠的作用;余偲等[10]研究显示,用短乳杆菌发酵添加L-谷氨酸的红枣汁,发酵后GABA含量增加了229.34 μg/mL。

与液态发酵相比,固态发酵具有环境友好、原料成本低廉且来源广泛等特点,在生物制造和食品产业中受到越来越多的关注[11]。固态发酵基质中存在固、液、气三种界面,不同界面间产生的界面效应增加了微生物代谢途径,使次级代谢产物产率更高[12-13]。近年来关于液态发酵红枣的研究不断增多,但利用固态发酵处理红枣的研究却鲜有报道。因此本实验以红枣碎为主料,用副干酪乳杆菌进行固态发酵,冷冻干燥后制得一种富含活菌的粉状制剂。通过检测发酵过程中活菌数和不同活性成分的动态变化,为开发新的红枣发酵制品提供一定理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

选用无霉变的红枣碎、豆粉 市售;MRS培养基 北京奥博星生物技术有限公司;葡萄糖、蔗糖、果糖、乳酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、富马酸、没食子酸、芦丁、对香豆酸 色谱纯、邻苯二甲醛、甘氨酸,上海源叶生物科技有限公司;浓硫酸 天津市化学试剂一厂;甲醇、乙腈 色谱纯,天津市化学试剂一厂;β-巯基乙醇 Sigma公司;福林酚 上海荔达生物科技有限公司;茚三酮 天津市恒兴化工贸易公司;牛津杯 苏州长留净化科技有限公司。

菌种:副干酪乳杆菌TK1501 天津科技大学实验室保藏,保藏编号为CGMCC NO.13130;沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 均保藏于天津科技大学酶工程实验室;AB204-S电子分析天平、PB1502-S电子天平 梅特勒-托利多仪器上海公司;1260 Infinity高效液相色谱仪 美国Agilent公司;TCL-12高速冷冻离心机 德国Eppendorf公司;HG75-3电热恒温培养箱 南京实验仪器厂;SP-2012UV紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司;100 mL玻璃瓶 四川蜀玻有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 发酵工艺

原料处理:工艺优化实验得出活菌数较高的底物配方为:红枣碎(直径1～2 mm)85%、豆粉15%,将配料倒入玻璃瓶中,再按料水比1∶0.9 (g/mL)加水搅拌均匀。

灭菌:混合后培养基放入高压灭菌锅,灭菌条件为100 ℃、30 min,灭菌结束后将瓶盖拧紧,冷却后备用。

接种发酵:按照10%接种量进行接种,接种后进行充分搅拌,拧紧瓶盖密闭发酵,发酵温度为37 ℃,发酵时间为48 h。发酵期间每隔6 h取样一次。

冷冻干燥:将取出样品冻干至含水量8%用于分析检测。

尤其是免门票的方式可以吸引更多的消费者，这也代表着当前旅游发展模式的方向，可以扩大旅游资源的利用效率，企业员工、游客、社区居民可在园区内共享优美环境、共享改革开放的成果，这也是全域旅游的目标导向之一。

1.2.2 指标测定

1.2.2.1 乳酸菌活菌数 根据GB 4789.2-2016《食品微生物学检验 菌落总数测定》检测活菌数。发酵过程中每隔6 h取样一次检测活菌数,绘制生长曲线。

1.2.2.2γ-氨基丁酸含量测定 衍生试剂的配制:邻苯二甲醛(OPA)10 mg,加入10 μLβ-巯基乙醇和2.5 mL乙腈混匀,避光保存。

样品处理:样品加3倍体积水稀释后备用。取样液100 μL,加入1 mL 0.4 mol/L的硼酸缓冲液(pH10.4)和OPA衍生液200 μL,混匀后衍生化反应30 min,4000 r/min条件下离心10 min,取上清液稀释,用0.22 μm滤膜过滤备用。

参考黄俊等[14]检测方法,用高效液相色谱法检测基质中GABA含量。色谱条件:C18柱(Thermo,250 mm×4.6 mm,美国);流动相A:四氢呋喃-甲醇-0.05 mol/L醋酸钠比例为(5∶75∶420);流动相B:甲醇;洗脱梯度为:0～6 min 80% A,6～20 min 20%～50% A,20～20.1 min 50%～100% A,20.1～27 min 100% A,27.1～30 min 20% A;紫外检测波长254 nm,进样量20 μL,柱温:30 ℃,流速:0.8 mL/min[14]。以GABA作为标准制作标准曲线,测得标准曲线为:y=0.0004x+0.0045,R2=0.9905。

1.2.2.3 不同碳源含量测定 样品处理:样品加3倍体积水稀释后50 ℃浸泡2 h。混合液4000 r/min条件下离心10 min,取上清液稀释20倍,用0.22 μm滤膜过滤备用。

参考王勇等[15]检测方法,用高效液相色谱法检测基质中葡萄糖、果糖、蔗糖含量。色谱条件为:流动相乙腈:水(75∶25);流速0.8 mL/min;色谱柱为Prevall Carb ES Column-W(Aglient,250 mm×4.6 mm,美国);柱温30 ℃;检测器条件:蒸发光检测器(Alltech 3300 ELSD);漂移管温度90 ℃,气体流速2.4 L/min,进样量20 μL[15]。分别以蔗糖、葡萄糖、果糖作为标准物,测得标准曲线见表1。

表1 不同糖类标准曲线Table 1 Different sugar standard curve

1.2.2.4 有机酸检测 样品处理:样品加3倍体积水稀释后4 ℃浸泡4 h。混合液4000 r/min条件下离心10 min,取上清液稀释2倍,用0.22 μm滤膜过滤备用。

采用高效液相色谱法检测基质中有机酸。色谱条件:流动相为5 mmol/L H2SO4溶液;色谱柱为Aminex HPX-87H(BIO-RAD,300 mm×7.8 mm,美国);流速0.4 mL/min;柱温30 ℃;紫外检测波长210 nm;进样量20 μL。分别以乳酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸、乙酸作为标准物,测得标准曲线见表2。

表2 不同有机酸标准曲线Table 2 Standard curves of different organic acids

1.2.2.5 粗多糖测定 根据SN/T4260-2015《出口食品源粗多糖的测定 苯酚-硫酸法》,以葡萄糖为标准制作标准曲线,测得标准曲线:y=0.1806x+0.0037,R2=0.9961。

1.2.2.6 游离氨基酸测定 样品处理方法:取1.00 g样品溶于9 mL去离子水中,4 ℃中静置4 h后4000 r/min离心20 min,取上清备用。采用茚三酮比色法检测样品中游离氨基[16]。以甘氨酸为标准制作标准曲线,测得标准曲线:y=0.0128x+0.0287,R2=0.9926。

1.2.2.7 多酚含量测定 样品处理方法:样品加5倍体积甲醇溶解后200 W超声提取40 min。混合液4000 r/min条件下离心10 min,取上清液用0.22 μm滤膜过滤备用。

参考王毕妮[17]检测方法,流动相A:甲醇;流动相B:1%甲酸水溶液;调整洗脱梯度为:0～8 min 15%～20% A,8～18 min 20%～60% A,18～30 min 60%～80% A,30～40 min 80% A,40～50 min 80%～15% A。分别以芦丁、对香豆酸、没食子酸为标准,测得标准曲线见表3。

表3 不同酚类物质标准曲线Table 3 Standard curves of different phenols

1.2.2.8 抑菌性能检测 样品处理:无菌条件下取不同时间段发酵的样品,分别加3倍体积无菌水进行稀释,4000 r/min离心10 min,取上清液备用。

液态LB培养基分别活化大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌,将活化后的菌液用无菌生理盐水进行梯度稀释至菌浓为1×108CFU/mL。向培养皿中倒入15 mL无菌LB培养基,静置20 min,待培养基凝固后分别取指示菌液150 μL均匀涂布在LB固体培养基表面,放置牛津杯(内径6 mm),加入样液200 μL,放入37 ℃培养箱中培养24 h,培养结束后用游标卡尺测量抑菌圈直径[18]。

1.3 数据处理

所有样品检测指标均进行3次平行检测,用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析,用Origin 2018绘图。

2 结果与分析

2.1 发酵过程中副干酪乳杆菌活菌数变化

生长曲线可以直观反映副干酪乳杆菌在红枣固态基质中的生长情况,基质中活菌数的变化情况如图1。

图1 副干酪乳杆菌在基质中的生长曲线Fig.1 Growth curve of Lactobacillus paracasei in matrix

从图1可以看出,随着时间变化,副干酪乳杆菌活菌数呈现先增长后下降的趋势。发酵24 h后活菌数达到最大值6.5×108CFU/g,24～36 h活菌数开始缓慢下降,36 h后下降速度逐渐加快。形成这一现象的主要原因是固态发酵体系中几乎没有可流动的自由水,物质传递速度慢,限制了微生物利用碳源的速度,导致前期菌体生长缓慢,达到最大值所需时间较长[19-20]。发酵体系长期处于37 ℃环境中发酵,且发酵过程中不补充水,发酵后期固态基质中水分蒸发减少导致菌体开始死亡,活菌数逐渐下降。

2.2 发酵过程中GABA含量变化

GABA是一种天然的活性物质,广泛存在于植物中,同时副干酪乳杆菌可以发酵产生GABA,进一步提高基质中GABA含量。发酵过程中GABA含量变化如图2。

图2 发酵过程中GABA含量的变化Fig.2 The change of the GABA during solid state fermentation注:不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图5、图6、图8同。

从图2可以看出,发酵前30 h副干酪乳杆菌产生GABA的速度逐渐加快,发酵48 h后GABA含量达到270.8 μg/g。副干酪乳杆菌可以通过谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)体系产生GABA[21]。发酵前期基质中营养物质充分,副干酪乳杆菌大量繁殖,GABA产量快速上升;发酵后期随着培养基中营养物质和水分的减少,副干酪乳杆菌繁殖速度减慢,不再大量产生GABA,底物中GABA含量逐渐稳定。

2.3 发酵过程中碳源的消耗情况

发酵过程中碳源减少情况如图3。

图3 发酵过程中不同碳源含量变化情况Fig.3 Changes in the concentration of different carbonsources in the substrate during fermentation

从图3可以看出,发酵前基质中葡萄糖、果糖、蔗糖含量分别为143.00、82.26、26.45 mg/g。0～24 h基质中葡萄糖浓度下降速度较快,说明该时间段内副干酪乳杆菌开始快速消耗葡萄糖进行生长代谢;30 h后随着菌体繁殖速度减慢,对葡萄糖的消耗量逐渐减少。发酵过程中蔗糖浓度下降了6.74 mg/g,果糖含量没有发生明显变化,说明该菌可以分解代谢红枣中的葡萄糖和蔗糖,但不能利用果糖。

2.4 发酵过程中有机酸含量变化

发酵过程中不同有机酸含量变化如图4。

图4 发酵过程中不同有机酸含量变化Fig.4 Changes in the content of differentorganic acids during fermentation

从图4可以看出,12～24 h基质中乳酸含量由7.82 mg/g快速增长至28.14 mg/g,36 h后增长速度逐渐缓慢;乙酸含量增加速度缓慢,发酵48 h后增加至1.93 mg/g;0～18 h苹果酸含量从5.78 mg/g上升到11.00 mg/g,18 h后含量开始下降;0～12 h柠檬酸含量从6.57 mg/g升至11.53 mg/g,12 h后开始下降。该过程中富马酸含量没有发生明显变化。

乳酸作为副干酪乳杆菌的主要产物,发酵过程中会不断产生乳酸,发酵12 h后副干酪乳杆菌大量繁殖代谢,增加了乳酸的含量,发酵36 h后副干酪乳杆菌开始进入衰亡期,活菌数的减少导致了产酸量逐步下降。导致苹果酸和柠檬酸含量先上升后下降的主要原因是固态发酵体系中存在顶空层(气相层)和物料层,菌体参与了有氧代谢和厌氧代谢两种代谢途径[22]。由于固态体系中本身含有少量氧气,因此发酵初期副干酪乳杆菌进行有氧呼吸产生了少量苹果酸和柠檬酸,发酵后期体系中氧气含量逐渐减少,副干酪乳杆菌以无氧呼吸为主,苹果酸被降解形成乳酸和乙酸[23]。该过程中富马酸含量没有发生明显变化,说明该菌既不产生也不利用富马酸。

2.5 发酵过程中粗多糖含量变化情况

副干酪乳杆菌几乎不能分解利用多糖,发酵前原基质中的粗多糖来源于发酵底物。从图5可知,发酵过程中粗多糖含量一直在上升,粗多糖含量由208.03 mg/g增加到237.72 mg/g。副干酪乳杆菌有产生多糖能力,发酵过程中培养基成分和发酵条件都会影响多糖的产量,其中葡萄糖和蔗糖作为合成多糖的重要前体物质对多糖产量影响最明显。有报告指出,较高的葡萄糖和蔗糖利用率可以使多糖产量增加24%左右[24]。检测发酵过程中三种糖的消耗情况,检测结果显示,发酵过程中副干酪乳杆菌除葡萄糖外还可以利用少量蔗糖,对产生多糖有促进作用。

图5 发酵过程中粗多糖含量变化Fig.5 Changes in crude polysaccharidecontent during fermentation

2.6 发酵过程中游离氨基酸含量变化

从图6可以看出,0～18 h之间游离氨基酸含量增长缓慢,18～36 h蛋白质分解速度加快,游离氨基酸浓度从265.21 μg/g升高至356.15 μg/g。发酵初期由于微生物数量较少,有机酸产量低,蛋白质分解缓慢;12 h后基质中活菌数增加,副干酪乳杆菌代谢产生了大量有机酸,酸性环境激活了植物内某些内源性蛋白酶活性,在酸性环境和酶的共同作用下,大分子蛋白物质被降解,增加游离氨基酸的含量[25]。与蛋白质相比,游离氨基酸有更好的消化性和生理活性。Gänzle等[26]的研究显示经过乳酸菌的发酵可以有效分解小麦蛋白,形成小分子多肽和氨基酸,提高蛋白质的消化性。

图6 发酵过程中游离氨基酸含量变化Fig.6 Changes in free amino acid content during fermentation

2.7 发酵过程中不同多酚含量变化

多酚是红枣中重要的活性成分,发酵过程中多酚含量变化如图7。

图7 发酵过程中不同酚类物质含量变化Fig.7 Changes in the content of differentphenolic substances during fermentation

从图7可以看出,固态发酵对不同酚类物质破坏程度不同。发酵过程中芦丁含量在不断下降,发酵48 h后含量从26.70 μg/g降至9.49 μg/g。没食子酸在前12 h内含量稳定,12 h后含量开始逐渐下降。检测结果显示该过程对对香豆酸的含量没有明显影响。造成部分多酚类物质含量下降的原因是固态发酵初期基质中含有的少量氧气对酚类成分有一定的破坏作用,并且随着发酵过程中菌体数量的不断增加,菌体分解代谢了部分多酚类物质,导致多酚类物质进一步减少[10]。

2.8 发酵过程中抑菌性能变化

发酵过程中样品对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌能力变化如图8。

图8 发酵过程中样品抑菌性变化Fig.8 Bacteriostasis changes of samples during fermentation

抑菌圈直径大小可以反映样品的抑菌能力,通过检测抑菌圈大小可以评判发酵过程中样品抑菌性能的变化[27]。检测结果显示,未发酵的样品对大肠杆菌和金黄色葡萄糖球菌没有抑菌能力,对沙门氏菌有一定抑制作用,发酵后的样品对三种菌的抑制效果为沙门氏菌>大肠杆菌>金黄色葡萄球菌。红枣含有大量有机酸,可以降低环境pH,低pH条件不利于沙门氏菌繁殖,因此抑制了沙门氏菌的生长。随着发酵时间的增加,副干酪乳杆菌产生的有机酸不断积累,使得体系中pH大幅下降,同时副干酪乳杆菌在生长过程中会产生H2O2、细菌素和抑菌肽等物质,该类成分可以抑制甚至杀死部分致病菌,提高了发酵后样品的抑菌性[28]。但发酵后样品对金黄色葡萄球菌的抑菌能力提升较小,说明金黄色葡萄球菌对副干酪乳杆菌产生的抑菌物质不敏感。

3 结论

本实验以红枣碎为主要原料,用副干酪乳杆菌进行固态发酵,探究发酵过程中不同活性物质和抑菌性的变化情况,结果显示:固态发酵过程中活菌数先快速增长然后缓慢下降,GABA、粗多糖、乳酸、乙酸、游离氨基酸含量和抑菌性呈现先快后慢的增长趋势,富马酸、苹果酸、柠檬酸含量无明显变化,芦丁、对香豆酸和没食子酸含量有不同程度的下降。

副干酪乳杆菌通过分解代谢葡萄糖和蔗糖产生有机酸和多糖,产生的有机酸可以激活内源性蛋白酶的活性,促使蛋白质被分解成小分子游离氨基酸,谷氨酸则通过GAD体系被转化为GABA。基质中的红枣碎主要提供碳源和生长所需的部分微量元素,维持副干酪乳杆菌的正常繁殖代谢,并且红枣中较高的葡萄糖和蔗糖含量有利于提高粗多糖的产量。基质中豆粉主要提供氮源,适宜的碳氮源比例可以提高微生物的生物量,进一步增加活菌数,同时豆粉中蛋白质含量丰富,可以提高游离氨基酸的产量。多酚物质的检测结果显示,发酵48 h后没食子酸含量下降了51.62%,芦丁含量下降了64.43%,说明固态发酵对红枣中的多酚类物质有一定破坏作用,因此需要控制发酵时间。对发酵过程中活性物质含量变化进行显著性分析,发现发酵24 h底物中活菌数达到最大值6.5×108CFU/g,与其他时间段相比差异显著(P<0.05),且此时底物中GABA、粗多糖和游离氨基酸含量较高,多酚类物质破坏程度小,因此选择24 h为最佳发酵时间。

综上所述,副干酪乳杆菌固态发酵红枣碎可以提高活性益生菌、粗多糖、GABA和游离氨基酸等活性物质的含量,还增强了产品的抑菌性能,制得的固态红枣益生菌产品有易携带、耐储藏等优点,是一种经济、高效的发酵方法,但对于如何减少发酵过程中多酚物质被破坏还需进一步研究。以上结论为开发富含活菌和多种活性成分的红枣固态产品提供一定理论参考。