茶枝柑果肉发酵过程中感官特性及抗氧化活性的变化

周 林,胡金梅,洪峻峰,黄志枫

(1.广东药科大学,广东广州 510006; 2.广东环境保护工程职业学院,广东佛山 528216)

茶枝柑(Citrusreticulata‘chachi’)别名大红柑、新会柑,是广东新会的传统栽培柑橘品种,已有700多年的栽培历史[1]。以新会茶枝柑加工的新会陈皮在2006年获批中国地理标志产品,2018年行业产值达到60亿元。由于未成熟的茶枝柑果肉口感青涩,榨汁后会释放柠檬苦素等物质,使果汁里带有苦涩的口感而难以食用[2-3],因此制作陈皮后的果肉被大量废弃,浪费资源的同时还产生一定的环境问题。而茶枝柑果肉富含糖类、有机酸、维生素、膳食纤维、黄酮、多酚等生物活性物质[4],应该得到更好的利用。

表1 CFJ感官评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria of CFJ

研究人员已经开展了茶枝柑果酒[2]、果醋[3]的加工工艺研究。近年来以果汁、蔬菜汁为主要原料,经乳酸菌或酵母菌单独或混合发酵制成的发酵食品、发酵果蔬汁越来越受到消费者的青睐[5],也为茶枝柑果肉的加工利用提供了新的契机。研究发现,通过益生菌发酵可以保持或改善果蔬的营养及感官特性[6-7];相比于苹果汁、菠萝汁、杏汁和葡萄汁,柑橘汁表现出更强的抗氧化活性[8]。而经过酵母菌20 ℃ 15 d发酵的柑橘汁,类胡萝卜素和黄酮含量增加,抗氧化活性增强[9]。在确保果蔬营养的同时,改善口感欠佳的果蔬风味,缩短发酵时间,成为开发具有市场竞争力的茶枝柑果肉发酵方法的关键。因而,高效的茶枝柑果肉发酵方法的建立,不仅有利于解决茶枝柑果肉废弃产生的环境污染问题,也为当地农民增收开辟一条新途径,具有良好的社会意义和潜在的商业价值。

本实验以茶枝柑果肉为原料,经酵母菌发酵后制备成一种新型的茶枝柑发酵果汁(fermenting juice of chachi,CFJ),研究其发酵过程中的感官特性、香气成分、总酸、还原糖、总酚、总黄酮等营养成分以及抗氧化活性,以期揭示CFJ发酵过程中风味口感、营养成分和抗氧化活性的变化,为新会茶枝柑果肉及相关产品的开发利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

茶枝柑 8月份采摘的制作陈皮用青柑,广东新会江门丽宫国际食品有限公司惠赠;酵母菌种 市售安琪高活性干酵母粉。葡萄糖 食品级,广州市琪福食品有限公司;3,5-二硝基水杨酸、福林酚 上海麦克林生化科技有限公司;亚硫酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝、酚酞、碳酸钠、乙醇、甲醇、硫酸亚铁 分析纯,天津市致远化学试剂有限公司;蒸馏水 广州屈臣氏食品饮料有限公司;没食子酸标准品、芦丁标准品(纯度均≥98%) 南京源植生物科技有限公司;邻菲罗啉 分析纯,广州化学试剂厂;pH7.4 磷酸盐缓冲液(PBS)(干粉) 北京酷来搏科技有限公司;过氧化氢 分析纯,天津市百世化工有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH) 福州飞净生物科技有限公司;一次性无菌注射器 湖南平安医械科技有限公司;0.45 μm微孔过滤膜 天津市科亿隆实验设备有限公司。

WJE-L榨汁机 浙江宁波沃玛电器有限公司;PA-12C酸奶机 中山市领锐电器有限公司;JJ-2000B电子天平 美国双杰兄弟(集团)有限公司;HHS-2S恒温水浴锅 上海宜昌仪器纱筛厂;SC-06离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司;UV-5500PC紫外分光光度计 广州市深华生物技术有限公司;7890B GC-MS液相色谱-质谱联用仪 Agilent公司。

1.2 实验方法

1.2.1 CFJ的制备 挑选完整无损伤的茶枝柑,蒸馏水清洗干净后去皮,用榨汁机对果肉进行榨汁,然后将果汁转移到酸奶机中,加入40%葡萄糖以及0.5%的酵母菌种,40 ℃发酵96 h。根据产品说明书,该酵母可以耐受40～42 ℃高温。每隔24 h对发酵果汁进行搅拌,同时取样置于离心管中,10000 r/min离心10 min,上清液过0.45 μm滤膜后-20 ℃保存备用。

1.2.2 CFJ的感官评价 每隔24 h取出适量的茶枝柑发酵果汁,由6人组成的评价小组对色泽、组织状态、酸味、甜味、苦涩、香气进行感官评价[10-11],其中4名男性,2名女性,同一批样品取样后随机提供给感官评价人员。评分标准见表1。

1.2.3 CFJ主要活性成分的测定

1.2.3.1 还原糖含量的测定 通过DNS法测定茶枝柑发酵果汁中还原糖含量[12]。标准曲线为y=1.3166x-0.0340,R2=0.993,x为葡萄糖浓度(mg/mL)。

1.2.3.2 总酸含量的测定 参考国标GB/T 12456-2008的酸碱滴定法[13]。

1.2.3.3 总酚含量的测定 参考Surveswaran等[14]的方法以没食子酸为标准品,通过加入福林酚和碳酸钠溶液显色后进行OD760分光光度法测定和计算。标准曲线为y=1.1010x+0.0420,R2=0.995,x为没食子酸浓度(mg/mL)。

表2 CFJ感官评价结果Table 2 Sensory evaluation of CFJ

1.2.3.4 总黄酮含量的测定 参考Kim等[15]的方法,以芦丁标准品和30%的乙醇配制成浓度为0.2 mg/mL芦丁标准溶液。测定体系为:0.3 mL 5%亚硝酸钠溶液,加入0.3 mL 10%硝酸铝溶液,混匀静置6 min;加入2 mL 1 mol/L氢氧化钠溶液,混匀;最后加入2.4 mL 30%乙醇,混匀后暗处静置10 min,于510 nm处采用分光光度法测定和计算。标准曲线为y=11.2570x-0.0081,R2=0.999,x为芦丁浓度(mg/mL)。

1.2.3.5 GC-MS测定香气成分的含量 取出冻存的果汁样品,在30 ℃的水浴中迅速解冻,精确量取果汁5 mL放入5 mL的饱和NaCl水溶液中,置于20 mL螺口顶空瓶中,用聚四氟乙烯隔垫密封瓶盖旋紧后混匀,上机检测。萃取针头:DVB/CAR/PDMS(50/30 μm),40 ℃平衡5 min,顶空吸附40 min,解析3 min。色谱条件:使用Rxi-lms毛细管气相色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)。升温程序为:初始温度34 ℃,以5 ℃/min的速度升至100 ℃,再以3 ℃/min的速度升至110 ℃,最后以10 ℃/min的速度升至230 ℃,保持2 min。载气He(纯度大于99.999%),不分流,流速1.38 mL/min。进样口温度250 ℃,传输线温度为250 ℃。

质谱条件:离子源温度设为200 ℃,电离方式为EI,电子能量设为70 eV,扫描范围为35～500 m/z。

定性采用各组分在图谱库NIST(依据检测处的图谱库)进行匹配,采用匹配程度大于80%的鉴定结果,并与文献资料[16-17]分析结果进行比对分析,峰面积归一法计算挥发性物质的相对百分含量。

1.2.4 CFJ抗氧化活性的测定

1.2.4.1 ·OH清除率测定 参考文献分光光度法测定[18]:测定体系为0.5 mL邻菲罗啉溶液和1.0 mL 浓度为0.75 mol/L,pH7.4的PBS缓冲液;加入0.5 mL待测样品和0.5 mL 0.01% H2O2,振荡摇匀,37 ℃水浴60 min,在536 nm处测定吸光值A2。以等体积水代替H2O2溶液,测定吸光值A1,以扣除样品本身颜色干扰;以等体积水代替样品,为空白样,测定吸光值A0,每份样品平行测定3次,取平均值。按式(1)计算样品·OH的清除率:

式(1)

1.2.4.2 DPPH·清除率测定 参考文献[19]分光光度法测定:测定体系为2 mL 0.180 mmol/L DPPH溶液和0.065 mL样品,振荡摇匀,室温放置30 min,测定514 nm处的吸光度值A2,用等体积的无水甲醇代替DPPH溶液,测定吸光值A1,以扣除样品本身颜色干扰;以等体积无水甲醇代替样品,为空白样,测定吸光值A0,每份样品平行测定3次,取平均值。按式(2)计算样品DPPH·的清除率:

式(2)

1.3 数据处理

除GC-MS数据外,每组实验重复3次,实验结果以均数±标准差(Mean±SD)表示,应用统计学软件SPSS 21.0对实验数据进行相关性分析。

2 结果与分析

2.1 CFJ感官评价

如表2和图1所示,CFJ发酵前后的感官特性变化主要表现在:直接提取的茶质柑果汁口感酸涩,难以入口,添加了40%葡萄糖后,甜味明显增加,但是苦涩感强;发酵后的CFJ口感酸甜适中,苦涩感较弱。发酵前的CFJ果香味较浓;发酵后的CFJ发酵风味较浓而果香味较淡。发酵前的CFJ质地均匀,无沉淀;发酵后的CFJ有少量沉淀。CFJ发酵前后口感的变化需要结合后续的理化指标进行分析。

图1 CFJ感官评价雷达图Fig.1 Radar map of sensory evaluation of CFJ

2.2 CFJ发酵过程主要活性成分含量变化

如图2a所示,从0～96 h随着发酵的进行,CFJ中的还原糖被菌体利用而减少,其中在发酵0～24 h期间,还原糖含量下降幅度最大,减少了14.1%,可能是因为酵母菌种处于对数生长期,碳源迅速消耗。同时,总酸含量逐渐下降,然后趋于稳定,柠檬酸和苹果酸是各种柑橘中主要的酸类物质[20],在兼性厌氧或厌氧条件下被酵母菌分解,生成乙醇和CO2,从而导致总酸含量的下降,在其它果汁发酵过程中总酸含量也表现出相似的变化趋势[21]。

表3 CFJ发酵过程中挥发性成分和相对含量Table 3 Volatile extracts and their relative contents in fermentation process of CFJ

图2 CFJ发酵过程中总酸、还原糖、总酚、总黄酮含量的变化Fig.2 Changes of the total acid,reducing sugar,total phenolicand total flavonoid contents in fermentation process of CFJ注:a:总酸和还原糖;b:总酚和总黄酮。

发酵0～48 h,总酚和总黄酮含量亦呈下降趋势(图2b),与陈亚楠等[22]用乳酸菌发酵陈皮柑饮料的结果相似,可能是酚类物质自身容易氧化分解导致含量下降。48～96 h,总酚和黄酮含量略有增加,可能是随着发酵的进行,乙醇和CO2的含量增加,有利于茶枝柑果汁中的酚类物质被浸出,导致其含量的增加。

2.3 GC-MS测定香气成分的含量的结果

通过GC-MS检测CFJ发酵过程中产生的挥发性成分及其相对含量(表3),可知0～96 h发酵过程中,烯烃的相对含量最高,从53.70%增加至77.77%,主要成分为d-柠檬烯和γ-萜烯。其中d-柠檬烯在所有香气成分中含量最高,和文献[17]的报道一致。d-柠檬烯和γ-萜烯是同分异构体,分子式为C10H16,也是柑橘类水果中的天然成分和橙皮精油中的主要成分,分别呈新鲜橙子和柠檬香气[23]。其次是醇类,由34.50%降至16.05%,主要成分为α-松油醇和4-萜烯醇;α-松油醇和4-萜烯醇也是同分异构体,分子式为C10H18O,分别呈丁香味[24]、辛香和木香味[25]。酯类由7.74%降至2.14%,主要成分为2-(甲氨基)苯甲酸甲酯,周欣等[26]报道2-(甲氨基)苯甲酸甲酯作为新会陈皮含有的特定挥发性成分,可用于新会陈皮的鉴定。因此在果肉发酵液中也检测出了该成分。醛酮、酚类的相对含量均较低(<1%)。

综合上述结果,0～96 h发酵过程中上述烯烃成分增加,而醇类和酯类成分减少,这和茶枝柑果肉发酵后果香味有所保留,但是整体仍然减轻的感官评价是一致的。另外,发酵24 h以后香茅醇后没有检出,而香茅醇具有一定的苦味[27],可以推测感官评价中果汁经过发酵后,苦涩感降低可能与之存在一定的关联。这些挥发性物质种类和含量的变化有助于理解感官分析的结果,但是这些成分变化和感官变化之间的关系还需要深入研究,尤其是发酵后果汁液体组分中柠檬苦素、柠檬酸、苹果酸等含量的变化规律,需要结合对应的标准物质进行精确的定性和定量。

表4 主要化学成分与两种自由基清除率的相关性分析Table 4 Correlation analysis between main chemical components and scavenging rate of two free radicals

2.4 CFJ发酵过程抗氧化活性变化

CFJ发酵过程中体外抗氧化活性的测试结果见图3。发酵前含果肉的果汁混合液·OH和DPPH·清除率均为最大值,分别为85.57%和84.40%。发酵0～24 h两种自由基清除率有所下降,其中·OH清除率下降13.24%,DPPH·清除率下降26.98%,说明发酵后CFJ中抗氧化成分的含量减少。发酵48～96 h两种自由基清除率基本趋于平稳,说明茶枝柑果汁的部分活性物质和抗氧化性能在一定程度上达到稳定。已有陈皮提取物抗氧化活性与多酚含量呈正相关的报道[28],这和本研究中0～24 h CFJ抗氧化活性降低和黄酮、多酚类物质含量减少的实验结果是一致的。

图3 CFJ对·OH和DPPH·清除率的变化Fig.3 Changes of scavenging rateagainst ·OH and DPPH·by CFJ

2.5 主要活性成分与抗氧化活性能力相关性分析

利用SPSS 21.0软件对实验数据进行相关性分析(表4),可见DPPH·清除率与·OH清除率、总酚含量、总黄酮含量、总酸含量和还原糖含量均呈显著正相关(P<0.05),说明总酚含量、总黄酮含量、总酸含量和还原糖含量对DPPH·的清除有显著的影响。·OH清除率与总酸含量呈极显著相关(P<0.01);与总黄酮含量和还原糖含量均呈显著相关(P<0.05);与总酚含量无显著的相关性(P=0.075)。说明总酸含量对·OH的清除有极显著的影响,总黄酮含量和还原糖含量对·OH的清除有显著的影响,总酚含量对·OH的清除无显著的影响。综合上述结果说明,与·OH清除率相比较,DPPH·清除率可以更好地用于该发酵过程中总酚、总黄酮抗氧化活性的检测。

上述结果也可以说明,茶枝柑果汁中的活性成分含量决定果汁的抗氧化活性能力,但抗氧化活性能力的强弱并不是由单一的某种活性成分所决定的,而是各种抗氧化活性成分协同作用的结果。相关的报道有:Sicari等[29]研究了15种柑橘,发现酚类物质在柑橘水果总抗氧化能力占主导地位,黄酮类化合物具有重要的清除自由基的能力;Park等[30]采用乳酸菌发酵混合浆果汁后,其抗氧化活性呈现上升的趋势;Mousavi等[31]利用乳酸菌发酵石榴汁,发现花青素含量均显著降低,抗氧化活性呈现下降趋势。还有研究报道,采用混菌发酵方式,能增加发酵果汁中的黄酮、多酚含量,并提高其抗氧化能力[32-33]。因此,不同的实验研究得到的结果表现出一定的差异,这与实验材料、微生物菌种、处理方法和发酵条件等有关。需要说明的是,大多数果肉、果渣或果汁采用酵母菌发酵时温度为20～28 ℃,本实验中采用了耐高温的安琪酵母,主要是考虑到大规模发酵时相对较高的温度有利于降低发酵过程降温消耗的能源成本,表明在40 ℃进行的发酵达到了预期的目标。由于发酵温度不仅影响发酵终点到达的时间,还会影响菌体的氧化应激、代谢产物的类型[34],因而温度对茶枝柑果肉发酵过程的具体影响还有待深入。

3 结论

以茶枝柑果肉为原料,经安琪酵母40 ℃发酵96 h后制备成一种茶枝柑发酵果汁。在感官评价方面,茶枝柑发酵果汁口感酸甜适中,苦涩感较弱,带有淡淡的果香和浓郁的发酵风味,与酸涩的茶枝柑果肉相比在风味口感上有很大的改善。对挥发性香味物质的GS-MS分析表明,发酵后挥发性香气物质相对含量最高的为烯烃,由53.70%增加至77.77%;而醇类、酯类则有所降低,分别由34.50%降至16.05%,7.74%降至2.44%;醛酮类、酚类的含量均低于1%。发酵风味的改善与发酵过程中主要化学成分的改变有关。在体外抗氧化活性评价方面,茶枝柑发酵果汁对·OH和DPPH·的清除率有所下降,抗氧化活性能力有所降低,这与茶枝柑发酵果汁中多酚、黄酮等成分含量的下降有关。研究初步揭示了茶枝柑果肉发酵过程中风味成分和抗氧化活性变化的规律,为茶枝柑果肉饮料的开发提供了依据。