甘薯花青素合成酶（ANS）基因的克隆及其组织表达模式分析

杨慧珍

（山西农业大学农学院，山西太原030031）

甘薯（Ipomoea batatas）又称白薯、红薯、地瓜、番薯等，属旋花科番薯属植物，其块茎富含淀粉，在世界主要粮食作物产量中排名第7 位；在我国则仅次于水稻、小麦和玉米，居第4 位[1]。花青素属类黄酮化合物，作为一种很强的抗氧化剂，其具有调节机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、降血糖、增强记忆力以及抵抗病毒等医疗保健价值[2-4]。甘薯块茎的颜色是由花青素及次生代谢产物的含量不同而决定的，表现为白色、黄色、橙色和紫色等多种颜色。在花青素代谢中，关键酶的基因及表达量起主导性作用，影响花青素积累的关键酶主要有F3H、DFR、ANS、GT 等[5-6]。

花青素合成酶（Anthocyanidin synthase，ANS）是生物合成花青素后期的关键酶，其作用是催化无色花青素脱水氧化后形成有色的花青素[7]。迄今为止，花青素合成酶基因已经从金荞麦（Fagopyrum dibotrys）[8]、银杏（Ginkgo biloba）[9]、拟南芥（Arabidopsis thaliana）[10]和芥菜（Brassica juncea（L.）Czernajew）[11]等植物中克隆得到。

本研究室前期对白心甘薯（徐薯18 号）和紫心甘薯（徐紫薯3 号）移栽后90 d 不同组织样品进行转录组测序，获得差异表达基因，结合NCBI 中甘薯ANS 基因序列，通过PCR 扩增获得徐紫薯3 号的花青素合成酶基因IbANS，对其基因编码序列进行生物信息学分析；并用real-time PCR 法分析该基因在不同甘薯品种及不同组织中的表达差异，旨在为紫心甘薯花青素形成的分子机制研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 紫心甘薯徐紫薯3 号和白心甘薯徐薯18 号于2018 年5 月种植于山西省农业科学院东阳试验田，移栽后90 d，分别取块根、茎和叶新鲜材料，装入灭过菌的离心管中，立即加液氮，然后置于-80 ℃冰箱内保存。

1.1.2 仪器 琼脂糖水平电泳仪（DYCP32A，北京），实时荧光定量 PCR 仪（ABI 7500Fast，美国）。

1.1.3 试剂 RNA 提取试剂Trizol Reagent、反转录试 剂 盒 Prime ScriptTMRT reagent Kit、pMD18-T 载体、实时荧光定量试剂盒SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ、pMD19-T，均购自中国Takara 公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；PCR引物合成、PCR 产物测序均由上海生工生物工程有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 总RNA 的提取和cDNA 的反转录 使用Trizol 法提取紫心甘薯徐紫薯3 号叶片的总RNA，按照反转录试剂盒Prime ScriptTMRT reagent Kit 说明书中的步骤合成cDNA，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 甘薯ANS 基因cDNA 的获得 利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）Gene 数据库检索甘薯ANS，然后在前期测序的甘薯转录组数据中BLAST搜素ANS 同源序列，利用Primer 5.0 设计特异引物（上游引物：5′-IbANS-PF AATGGTGACTACTATTA CTGTTCCG-3′下游引物：5′-IbANS-PR CAACCAT AATAATACCAAACGG-3′），以紫心甘薯叶片 cDNA为模板，PCR 产物跑胶检测，割胶回收目标条带，连接到pMD18-T 载体上，然后转化大肠杆菌，挑取单克隆培养，菌液PCR 筛选后送上海生工生物工程公司进行测序。

1.2.3 生物信息学分析 用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）对ANS 的一级结构及其理化性质进行分析；用SOPMA 预测ANS 蛋白的二级结构；用TMH MMServerv.2.0 预测ANS 蛋白质跨膜方向和跨膜区；用ProtScale 对ANS 的疏水性/亲水性进行分析；用expasy 预测蛋白功能结构域；用Sigalp 对ANS 蛋白信号肽进行预测；用ProtComp预测蛋白的亚细胞定位；用SWISS-MODEL 对ANS蛋白三维结构图建模；用DNAMAN 6.0 软件对氨基酸序列进行同源性比对；使用MEGA 7.0 软件用邻接法构建系统进化树。

1.2.4 实时荧光定量PCR 检测 根据获得的甘薯ANS 基因的核酸序列，利用Primer 5.0 在线软件设计荧光定量引物（IbANS-real-F：5′-CCTCCAAGTC CTCCGAGTTGAT-3′；IbANS-real-R：5′- TACATA AGGCCGGAGGAAGAGC-3′）。以白心甘薯和紫心甘薯块根、茎、叶的cDNA 为模板，选取IbARF 基因（F：5′- CTTTGCCAAGAAGGAGATGC-3′，R：5′-TC TTGTCCTGACCACCAACA-3′）作为内参基因，参照TaKaRa 公司的SYBRRPremix Ex TaqTMII 说明书，进行实时荧光定量分析。反应体系为：cDNA 模板1 μL，10 μmol/L PF/PR 0.4 μL，SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ5.0 μL，RNase free H2O3.2 μL。反应程序设置为：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性 10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 20 s，共 40 个循环。每个样品设有3 次重复，使用 2-ΔΔCT法计算出目的基因的表达量。

1.3 数据分析

数据处理和作图采用Excel 软件，组织间基因表达量采用SPSS v23 one-way ANOVA 法进行差异显著性分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 甘薯IbANS 基因克隆与电泳检测

用设计的基因特异引物进行PCR 扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出大小约1 200 bp的预期条带（图1）。

2.2 理化性质分析结果

经ProtParam 对甘薯的ANS 蛋白理化性质进行预测分析，结果表明，蛋白的分子质量为40531.27ku，分子式为C1813H2855N487O542S12，总原子数为5 709，氨基酸为362 个。在该基因编码的氨基酸中，不含Sec（U）和Pyl（O），Trp（W）、Cys（C）的含量均为1.4%，含量最高的是Glu（E），占11.0%。总的带正电残基（Asp＋Glu）为 56、负电残基（Arg＋Lys）为 43。等电点pI 为5.32，不稳定系数为43.33，属不稳定蛋白质。脂肪指数为84.81，亲水性评估分值为-0.141，因此，该蛋白预测为亲水性蛋白质。

2.3 亲/疏水性分析结果

通过ProtScale 软件进行疏水性/亲水性预测，结果如图2 所示，表明ANS 蛋白为亲水性蛋白，与2.1 理化性质分析结果一致。

2.4 蛋白跨膜结构域及保守结构域分析

经TM H M M 软件预测蛋白质跨膜区和跨膜方向，结果显示，没有跨膜螺旋模型（概率均小于0.5），没有明显跨膜现象（图3）。说明蛋白中没有跨膜区。

利用expasy 预测蛋白功能结构域，结果如图4所示，该基因编码的蛋白具有典型的Fe2+- 依赖的双加氧酶家族（2OG-FeII_Oxy）和2-O- 酮戊二酸的保守结构域，位于第212—311 个氨基酸。

2.5 蛋白信号肽预测

用Sigalp 4.1 对ANS 蛋白进行信号肽及切割位点预测，采用神经网络（NN）算法。其中，Y-score 是综合剪切位点的分值，S-score 是信号肽的分值，C-score 是原始剪切位点的分值。由图5 可知，蛋白质中无信号肽存在的可能，属于非分泌蛋白。

2.6 亚细胞定位预测

使用PSORT II 数据库对ANS 蛋白进行亚细胞定位分析，结果表明，甘薯ANS 蛋白质定位在细胞质上的比率为45%，定位在微体（过氧化物酶体）上的比率为30%，定位在线粒体基质上的比率为10%，定位在叶绿体类囊体膜上的比率为10%。

2.7 蛋白质二级结构预测

利用SOPMA 软件对ANS 蛋白进行二级结构的预测，结果如图6 所示，甘薯ANS 蛋白的二级结构主要由 α- 螺旋（占35.36%）、β- 折叠（16.85%）、无规则卷曲（41.44%）和延伸链（6.35%）构成。其中，α- 螺旋和β- 折叠是维持蛋白质分子相对稳定性的重要结构，而在甘薯ANS 蛋白质中，α- 螺旋与β-折叠所占比例不高，且无规则卷曲很多，说明这种蛋白质的稳定性较弱，这与2.1 理化性质的分析结果一致。

2.8 蛋白质三级结构预测

利用SWISS-MODEL 对甘薯ANS 蛋白进行三维结构建模，结果表明（图7），ANS 蛋白三维结构主要包括α- 螺旋和无规则卷曲，与2.6 二级结构预测结果相符。在模板结果页面（Template Results）中，模型匹配到的最佳模板为2brt.1.A，相似度达到78.11%，可以该模板的三维结构作为参考。

2.9 系统进化树分析

从NCBI 上搜索到其他物种的ANS 序列，使用DNAMAN 软件进行氨基酸序列比对，结果如图8所示，紫心甘薯ANS 蛋白同其他植物的ANS 蛋白具有较高的序列相似度，用DNAMAN 软件计算其相似度为88.15%，且各ANS 蛋白序列中均具有Fe2+- 依赖的双加氧酶家族（2OG-FeII_Oxy）的保守结构域，说明ANS 蛋白在不同植物间高度保守。

使用MEGA 7.0 软件，构建甘薯和其他植物氨基酸序列进化树如图9 所示。结果表明，甘薯与三浅裂野牵牛（Ipomoea trifida）亲缘关系最近，与同属（Ipomoea）的植物聚为一簇，与陆地棉、黄牡丹、枫香的亲缘关系较远；系统发育进化树逐级分支，具有较多层级，说明ANS 蛋白的进化兼具保守性和物种特异性。

2.10 实时荧光定量 PCR 检测ANS 基因的组织表达结果

利用qRT-PCR 检测IbANS 基因在紫心甘薯（徐紫薯3 号）和白心甘薯（徐薯18 号）的块根、茎、叶组织中的表达水平，结果表明（图10），IbANS 基因在紫心甘薯（徐紫薯3 号）中表达水平大小表现为根＞茎＞叶，在白心甘薯（徐薯18 号）中的表达水平大小表现为茎＞叶＞根；紫心甘薯（徐紫薯3 号）根、茎、叶中的ANS 表达水平显著高于白心甘薯（徐薯 18 号）（P＜0.05）。

3 结论与讨论

植物花青素的代谢和调控已成为当前科学研究的热点，ANS基因在许多植物中已被克隆，并已证明其是花青素生物合成的重要结构基因。花青素合成酶是花色素苷合成末端的酶，影响花青素的累积，决定花色的形成及果实的着色[4]。ANS 是铁离子和2-O- 酮戊二酸依赖的双加氧酶家族，在保守结构域中的铁离子和2-O- 酮戊二酸的结合位点是细胞色素P450 家族基因中存在的活性中心结构[8]。本研究通过序列比对结合PCR 技术从实验室前期获得的转录组数据库中得到紫心甘薯徐紫薯3 号的ANS的全长cDNA 序列，对编码的蛋白质生物信息学进行分析，结果表明，该基因编码的蛋白具有典型的Fe2+- 依赖的双加氧酶家族（2OG-FeII_Oxy）的保守结构域。系统进化分析显示，甘薯与三浅裂野牵牛亲缘关系最近，与陆地棉、黄牡丹、枫香的同源性较低，亲缘关系较远，基本符合植物分类学的进化规律。

ANS基因的表达具有组织特异性，如金荞麦（Fagopyrum dibotrys）FdANS 在花期不同组织中的表达量大小表现为花＞叶＞茎＞根[8]；LIU 等[12]对甘薯（Ipomoea batatas）IbANS 的组织表达分析表明，IbANS 在所有组织中均有表达，但在块根及周皮中表达量较高。本研究利用实时荧光定量PCR 技术检测了紫心甘薯和白心甘薯不同组织中IbANS 的表达模式，结果发现，ANS基因的表达具有明显的组织特异性，在白心甘薯茎、叶中的表达量高于块根中，而在紫心甘薯块根中的表达量高于茎和叶。相关研究表明，ANS表达具有品种特异性，表达水平为深色＞浅色＞白色/无色品种，如水母雪莲花（Saussurea medusa）中，ANS 在红色系愈伤组织中的表达量高于白色系和绿色系[13]；紫甘蓝（Brassica oleracea var. capitata）ANS的表达水平明显高于青甘蓝[14]。本研究中，紫心甘薯块根、茎、叶中的ANS表达水平显著高于白心甘薯（P＜0.05），尤其在块根中的相对表达量是白心甘薯的37 倍，证实颜色较深的组织部位ANS基因的表达量较高，说明ANS可能参与紫心甘薯块根中花青素的积累。

ANS 是影响花青素合成的关键酶，在作物育种中，通过上调ANS 基因的表达，提高花青素的含量，培育花青素含量丰富的植物品种。REDDY 等[15]在水稻育种中通过过量表达ANS基因，增加转基因植株中花青素的含量，使水稻的种皮呈现紫红色。本研究结果进一步阐明IbANS 基因在紫心甘薯块根中的形成及累积机制，最终为培育富含花青素的甘薯新品种奠定一定的理论基础。