HPLC-ELSD 法同时测定康寿丸人参皂苷Rg1、Re、Rb1 的含量

黄天山，杨洁瑜，顾利红

广州市药品检验所，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，广州，510160

康寿丸质量标准目前收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十一册，处方由何首乌、人参、熟地黄、地骨皮等八味药组成，主要用于气血两虚，精血两虚，精血不足导致的身体瘦弱，神疲乏力，眩晕健忘，失眠多梦等症。现行质量标准中仅对人参进行薄层鉴别［1］，为了更好地控制产品质量，保证临床疗效，拟对方中人参进行含量测定研究。《中国药典》多采用HPLC-UV 法测定人参中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re 和人参皂苷Rb1的含量，分析时间较长，效率较低［2-4］。本文建立了HPLC-ELSD 法同时测定康寿丸中人参皂苷Rg1、人参皂苷Re 和人参皂苷Rb1含量的方法，为康寿丸的质量控制提供了实验依据。

1 仪器与试剂

万分之一电子天平（瑞士梅特勒托利多公司）；安捷伦1260 高效液相色谱仪（配置四元泵、自动进样器、柱温箱和Alltech 3300 蒸发光散射检测器），OpenLab CDS 色谱工作站。

人参皂苷Rg1对照品（批号为110703-201933，含量以93.4%计）；人参皂苷Re 对照品（批号为110754-201827，含量以93.4%计）；人参皂苷Rb1对照品（批号为110704-202028，含量以93.1%计）；均由中国食品药品检定研究院提供。乙腈为色谱纯（德国 Merck），水为超纯水，其他试剂均为分析纯（广州化学试剂厂）。康寿丸样品共10 批，分别由企业A 和企业B 提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件色谱柱：Waters CORTECS T3 C18（柱长150 mm，内径4.6 mm，粒径2.7 μm），以乙腈为流动相A，水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；采用蒸发光散射检测器，漂移管温度为50 ℃，载气流速为1.6 L/min，倍增系数为4。理论板数按人参皂苷Rg1峰计算不低于10 000，与相邻色谱峰的分离度不低于1.5。

表1 梯度洗脱程序

2.2 对照品溶液的制备取人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含人参皂苷Rg1180 μg、人参皂苷Re80 μg、人参皂苷Rb1100 μg 的混合溶液，即得。

2.3 供试品溶液及阴性对照溶液的制备取本品粉末（过四号筛）约3.5 g，精密称定，置锥形瓶中，加乙醚50 mL，加热回流1 h，放冷，滤过，弃去乙醚液，药渣挥干乙醚，连同滤纸移至锥形瓶中，精密加入水饱和正丁醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用水饱和正丁醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液25 mL，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

按处方取不含人参的各药味饮片，经粉碎按处方量及制法混合制成阴性样品，同供试品溶液的制备方法制备人参阴性对照溶液。

2.4 专属性试验分别精密吸取供试品溶液和人参阴性对照溶液各2 μL，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1混合对照品溶液各5 μL，依法测定，记录HPLC 色谱图，见图1。结果显示，人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1与其他组分峰的分离度均大于1.5，人参阴性对照溶液色谱中在与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品色谱峰相应的位置上，未见有色谱峰，说明阴性样品无干扰，方法具有专属性。

图1 HPLC色谱图

2.5 线性关系考察取人参皂苷Rg1对照品8 mg、人参皂苷Re 对照品8 mg、人参皂苷Rb1对照品10 mg，精密称定，置10 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液①。精密吸取对照品溶液①5.0 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液②。精密吸取对照品溶液②5.0 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液③。精密吸取对照品溶液③5.0 mL 置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液④。精密吸取对照品溶液④4.0 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液⑤。精密吸取对照品溶液⑤5.0 mL置10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液⑥。分别精密吸取对照品溶液①～⑥各4 μL 进样，依法测定，以峰面积积分值A 对数值为纵坐标，进样量C（μg）对数值为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数，见表2。表明人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1线性关系良好。

表2 人参皂苷Rg1、Re、Rb1线性考察结果（n=6）

2.6 精密度考察精密吸取对照品溶液（浓度：人参皂苷Rg185.27 μg/mL；人参皂苷Re 78.27 μg/mL；人参皂苷Rb196.03 μg/mL），连续进样6 次，记录峰面积，计算RSD。结果：人参皂苷Rg1RSD为1.9%，人参皂苷Re RSD 为1.9%，人参皂苷Rb1RSD 为1.6%，说明仪器的精密度良好。

2.7 重复性试验取同一批（批号：B07009）样品，精密称取6 份，依法制备供试液，进样测定，结果人参皂苷Rg1平均含量为0.29 mg/g，RSD 为2.2%；人参皂苷Re 平均含量为0.33 mg/g，RSD 为1.9%；人参皂苷Rb1平均含量为0.43 mg/g，RSD 为1.1%，表明本方法的重复性良好。

2.8 稳定性试验取同一份供试品溶液（批号190901），在室温放置0、4、8、12、16、20、24 h后分别进样，依法测定，人参皂苷Rg1含量平均值为0.138 mg/g，RSD 为1.5%；人参皂苷Re 含量平均值为0.194 mg/g，RSD 为1.9%；人参皂苷Rb1含量平均值为0.280 mg/g，RSD 为1.5%。表明供试品溶液在24 h 内测定结果稳定。

2.9 加样回收试验取已知含量（批号：B07009）的样品6 份，每份约1.75 g，精密称定，各精密加入混合对照品溶液（人参皂苷Rg1：0.255 3 mg/mL；人参皂苷Re：0.315 1 mg/mL；人参皂苷Rb1：0.402 8 mg/mL的混合溶液）2 mL，在水浴上挥干溶剂，自“加乙醚50 mL，”起同法制成供试品溶液，依法测定，人参皂苷Rg1、Re、Rb1的平均回收率分别为99.8%、100.9%、99.8%，RSD 分别为1.0%、1.7%、1.3%。

2.10 样品测定取所收集的A、B 两家企业共10批样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算结果见表3。

表3 人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量测定结果 mg/g

3 讨论

康寿丸组方复杂，若选择HPLC-UV 法，检测波长常为203 nm，属于紫外末端吸收，天冬、麦冬中的皂苷类成分及杂质会产生干扰，不宜选择紫外检测器。蒸发光散射检测器作为一款通用的检测器，无紫外末端吸收的干扰，有广泛的梯度和溶剂兼容性，图谱基线平稳［5］，适用于人参皂苷类成分的检测［6-9］，故本实验采用HPLC-ELSD 法对康寿丸中的人参皂苷类成分进行分析。

比较了三氯甲烷、二氯甲烷和乙醚的脱脂效果，发现不同溶剂脱脂后制备的供试液各液相色谱图在目标峰（人参皂苷Rg1、Re、Rb1）附近杂质干扰无明显差异，乙醚毒性较小，从绿色环保考虑，采用了乙醚除脂。同时还比较了甲醇、正丁醇和水饱和的正丁醇三种溶剂的提取效果，发现水饱和的正丁醇提取效果最好，故选择以水饱和的正丁醇作为提取溶剂。最后还对提取方式与时间进行了研究，发现回流提取比超声提取效果好，回流60 min 能最大限度地提取完全。

本方法采用了可以在普通液相使用的微粒径色谱柱，显著缩短了人参皂苷类成分的分析时间，比较了样品在不同色谱柱（Waters CORTECS T3 C18、YMC Meteoric C18、Agilent InfinityLabPoroshell SBC18）和不同柱温（25 ℃、30 ℃、35 ℃）对分离效果和分析时间的影响，发现不同色谱柱和不同柱温均能获得良好的分离度，含量测定结果无明显差异。

本文对收集到的两家企业共10 批康寿丸样品进行了人参三个皂苷成分的含量测定，结果发现两家企业的人参皂苷含量差异较大，同一企业的不同批次样品含量差异不大，表明两个企业的投料来源比较稳定，但人参原药材质量存在一定差异。