抗植物软腐病枯草芽孢杆菌的高密度发酵优化

任玉文 任媛媛 刘雅祯 卢天华 刘力强 周晓辉

摘 要：为提高菌体产量，以益生菌枯草芽孢杆菌Asr作为发酵菌株，采用正交试验法和响应面法，对枯草芽孢杆菌Asr的发酵工艺进行了优化研究。结果表明，影响菌体产量最主要的3个因素为酵母浸粉、MgSO4和CaCl2;最佳发酵培养基配方为蔗糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉8.65 g/L，K2HPO4 3.0 g/L，MgSO4 0.27 g/L，CaCl2 0.53 g/L;最佳培养条件为温度37 ℃、初始pH值7.0、接种量10%、搅拌转速250 r/min;应用优化配方及工艺，枯草芽孢杆菌Asr的最高产量达到7.30×108 cfu/mL，菌体产量较优化前提高了3.95倍。研究结果可为后续菌体发酵罐的扩大培养提供技术支撑，对其他枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化研究提供借鉴。

关键词：发酵工程;枯草芽孢杆菌;发酵工艺;正交法;响应面法;优化

中图分类号：TS2021   文獻标识码：A   doi：10.7535/hbkd.2020yx05007

Abstract：In order to increase yield，take the Bacillus subtilis Asr as the expreession strain， the fermentation process of Bacillus subtilis Asr was optimized by orthogonal test and response surface method. The results show that three main factors affecting bacterial yield are leaching yeast powder， MgSO4 and CaCl2. The best fermentation medium formulation is as following： sucrose 20 g/L， peptone 10 g/L， leaching yeast powder 8.65 g/L， K2HPO4 3.0 g/L， MgSO4 0.27 g/L and CaCl2 0.53 g/L. The optimal culture conditions are as following： 37 ℃， initial pH 7.0， inoculum of 10% and stirring speed of 250 r/min. After the optimization， the highest yield of Bacillus subtilis Asr reaches 7.30×108 cfu/mL， which is 3.95 times higher than that before optimization. The study provides a technical reference for the subsequent bacterial scale-up culture in fermentor and the optimization of fermentation medium from other Bacillus subtilis.

Keywords：fermentation engineering; Bacillus subtilis; fermentation process; orthogonal method; response surface method; optimization

植物软腐病是由果胶杆菌属细菌引起的植物病害，侵染植物组织或器官，对中国农业生产造成了巨大危害[1]，近年来由植物软腐病造成的农业损失数不胜数。如广东省的香蕉软腐病，最高发病率可达50%[2];北京通州地区2.5×107 m2的芹菜软腐病，使植株整体腐烂死亡，造成绝产[3];河北暴发的黄瓜软腐病，区域发病率最高可达到50%，产量损失严重[4]。目前对植物软腐病的防治方法有合理轮作、避免机械损伤、喷洒农药或植物水提液[5-8]等，这些方法不仅增加了人力消耗，还会造成环境污染、危害人体健康。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtlis）系芽孢杆菌属的一种，广泛分布于土壤及腐败的有机物中，适宜在枯草浸泡液中繁殖[9-12]。枯草芽孢杆菌是一种优良的生防菌和食品级益生菌[13-14]，具有很强的脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶等酶活性，代谢旺盛，对人畜无害，不污染环境，在食品、饲料和农业方面应用广泛[15-17]。在其生长过程中分泌细菌素、脂肽类化合物、有机酸类物质等，可有效抑制病原菌的生长或溶解病原菌[18]，因此在天然食品防腐和田间防治等方面[19]具有十分重要的意义。

在食品研究领域中，可通过优化发酵培养基提高枯草芽孢杆菌野生型菌株产酶或抗菌肽的能力[20-24]。本研究所用的枯草芽孢杆菌Asr，能够表达CpxP蛋白。经实验室前期研究发现，CpxP蛋白对含有软腐病胡萝卜的抑菌率达到44.89%，对马铃薯切片的抑菌率达到59.41%[25]。枯草芽孢杆菌Asr是将益生菌和抗菌蛋白进行协同作用，代替化学农药，有效抑制植物软腐病的发生，符合“健康食品、绿色食品”的生活理念。

目前有关枯草芽孢杆菌发酵培养基优化的研究有很多[26-27]。用这些培养基发酵枯草芽孢杆菌Asr，菌体产量偏低，最高产量仅为1.85×108 cfu/mL。本文以枯草芽孢杆菌Asr作为发酵菌株，通过对既定的发酵培养基进行正交试验和响应面试验，以OD600值作为最终响应结果，确定最佳发酵培养基配方。基于最佳发酵培养基配方，在3 L小型发酵罐中通过单因素试验探究最佳发酵温度、初始pH值、接种量及搅拌转速，进一步优化发酵工艺，以提高发酵液中的菌体密度，为其应用于食品业提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 菌株

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Asr：河北科技大学蛋白质工程实验室保藏。

1.1.2 主要试剂及仪器

蔗糖：天津市百世化工有限公司;蛋白胨、酵母浸粉：北京市奥博星生物技术有限责任公司;磷酸氢二钾（K2HPO4）：天津市鼎盛鑫化工有限公司;氯化钠（NaCl）：天津市永晟精细化工有限公司;硫酸镁（MgSO4）：天津市河东区红岩试剂厂。

电子天平T1000：常熟市双杰测试仪器厂;分析天平ME104/02：梅特勒-托利多（上海）有限公司;电子pH计STARTER3100/F：奥豪斯（上海）有限公司;磁力搅拌器HJ-4AS：江苏省金坛市荣华仪器公司;移液器：大龙医疗设备有限公司;冰箱BCD-189WDPV：海尔公司;超低温冷冻储存箱DW-HL100：中科美菱低温科技有限责任公司;单人单面垂直净化工作台SW-CJ-1FD、立式压力蒸汽灭菌器YXQ-30SII：上海博讯实业有限公司医疗设备厂;恒温培养振荡器ZWYR-4912：上海智城分析仪器制造有限公司;紫外可见分光光度计UV-5800（PC）：上海元析仪器有限公司;显微镜BA410E：麦克奥迪实业集团有限公司;3 L 5BG发酵罐：上海保兴生物设备工程有限公司。

1.1.3 培养基配方

平板琼脂培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，NaCl 10 g/L，琼脂15 g/L，pH值7.0 g/L，121 ℃条件下灭菌20 min。种子培养基：胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉5.0 g/L，NaCl 10 g/L，pH值7.0，121 ℃条件下灭菌20 min。原始发酵培养基：蔗糖20 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母浸粉10 g/L，K2HPO4 30 g/L，CaCl2 030 g/L，MgSO4 050 g/L，pH值7.0，121 ℃条件下灭菌20 min。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株培养条件

平板培养条件：从-80 ℃ 冰箱取出保藏菌株，在固体平板上划线进行菌株活化，37 ℃过夜培养。种子培养条件：挑取平板上的单菌落接种到种子培养基中，装液量50 mL/250 mL，180 r/min，37 ℃培养16 h。发酵培养条件：按5%（体积分数，下同）接种量将种子液接种到装液量50 mL/250 mL的发酵培养基中，180 r/min，37 ℃培养至稳定期。

1.2.2 测定指标和方法

取稳定期菌液，原始发酵培养基作为空白对照，使用紫外可见分光光度计测定OD600值。将菌液稀释到合适倍数后涂布到平板琼脂培养基上，计算活菌数。

1.2.3 菌株生长曲线的测定

将培养好的种子液，按5%的接种量接种于50 mL/250 mL的锥形瓶中，180 r/min，37 ℃培养。接种后每2 h取样1次，测定菌液的OD600值，以未接種种子液的发酵培养基作为空白对照。

1.2.4 6因素2水平正交试验

根据原始发酵培养基选择6个因素：蔗糖，蛋白胨，酵母浸粉，K2HPO4，MgSO4和CaCl2，进行6因素2水平正交试验。依据OD600值，做3个平行，通过极差大小进行数据分析，确定最优因素水平组合。

1.2.5 响应面试验

根据6因素2水平正交试验结果，选择极差最大的3种因素，设计3因素3水平的响应面试验（Box-Behnken），如表1所示。试验重复3次，以OD600值为响应值，确定最优发酵培养基。

1.2.6 发酵条件的优化

在优化培养基配方的基础上，分别对枯草芽孢杆菌Asr的培养温度（28，31，34，37，40 ℃）、初始pH值（6.0，6.5，7.0，7.5，8.0）、接种量（1%，3%，5%，10%，15%）、搅拌转速（100，150，200，250，300 r/min）4个发酵条件进行3 L小型发酵罐单因素优化试验[28]，发酵时间为14 h，以OD600值和活菌数作为分析参考依据。

2 结果分析

菌株在原始发酵培养基中的生长曲线如图1所示。由图1可知，在0～2 h处于生长延滞期，菌体密度小;2～12 h处于生长指数期，菌体密度上升极快，菌体数量急剧增多;在12 h时达到峰值;12～24 h处于生长稳定期，菌群数量维持稳定。因此选取12 h作为正交试验、响应面试验的测试时间，此时枯草芽孢杆菌为对数生长末期，既可以保持高的细胞活力，又可以获得尽可能多的细胞数。

2.2 6因素2水平正交试验结果分析

6因素2水平正交试验设计及极差分析如表2所示，正交试验方差分析如表3所示。根据极差分析结果，各因素对OD600值的影响顺序依次是：酵母浸粉>MgSO4>CaCl2>蔗糖>K2HPO4>蛋白胨;根据方差分析，酵母浸粉，MgSO4，CaCl2对OD600值具有显著影响。可以分别选择蔗糖、K2HPO4、蛋白胨的最好水平，即蔗糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，K2HPO4 3 g/L，通过响应面法重点考察酵母浸粉、CaCl2和MgSO4 3个主要因素对菌株的影响。

2.3 响应面试验设计与结果分析

利用响应面软件（Design Expert 8.0）中的Box-Behnken设计以酵母浸粉、MgSO4和CaCl2 3个因素为自变量的试验，将OD600值作为响应值，共有17个试验点，每个试验点设3个平行。17个试验点可分为2类：一类是中心试验点，中心试验点重复5次，以估计试验误差[29-31];另一类是非中心试验点，共12个。试验设计及结果如表4所示。

对回归模型进行方差分析，结果如表5所示。由表5可知，酵母浸粉和MgSO4对OD600值均具有显著影响（P<0.05），回归模型P值<0.01，达到极显著水平，失拟项的P值>0.05，为不显著水平。说明所构建的回归模型显著，能够真实反映试验情况。决定系数R2=0.963 5，修正决定系数R2=0.916 6>0.900 0，说明回归模拟程度好。

为进一步研究相关变量因素之间的交互作用，确定最优点，利用软件分析二次回归模型，绘制了3个影响因素之间的响应面分析立体图和等高线图，如图2所示。图2中等高线均呈椭圆形，表明各因素的交互作用显著[32]，同时得到最佳培养基配方为酵母浸粉8.65 g/L，MgSO4 0.27 g/L，CaCl2 0.53 g/L。经过3次重复试验，OD600值达到4.18，相比培养基优化前，提高了17%;菌数平均数从1.85×108 cfu/mL提高到3.25×108 cfu/mL，提高到培养基优化前的1.76倍。

2.4 培养条件的优化

2.4.1 不同培养温度对菌株发酵产量的影响

低温和高温对枯草芽孢杆菌Asr的生长均有不同程度的影响，温度过高或过低都会延迟枯草芽孢杆菌的生长，降低生物合成量。在28～40 ℃温度范围内，出现生长拐点，37 ℃时OD600值最大（见图3 a））。因此枯草芽孢杆菌Asr的最适宜发酵温度为37 ℃。

2.4.2 不同初始pH值对菌株发酵产量的影响

初始pH值高呈碱性，会破坏枯草芽孢杆菌细胞膜的电荷，从而降低枯草芽孢杆菌对营养物质的吸收及利用率;pH值低呈酸性，会降低菌体细胞内多种酶的活性[31]。初始pH值为7.0时，与其他初始pH值组D600值存在较大差异;当培养液初始pH值为7.5时，发酵液OD600值开始显著下降（见图3 b））。因此，枯草芽孢杆菌Asr最适宜初始pH值为7.0。

2.4.3 不同接种量对菌株发酵产量的影响

枯草芽孢杆菌接种量过大，会导致发酵液中初始菌浓度偏高，减小菌体扩增倍数，抑制菌体代谢生长，还会导致菌体溶氧量的竞争性抑制，降低菌体活性和生产效益;接种量过小，则会降低单位时间内的产量[33];当接种量为10%时，OD600值最大（见图3 c））。因此得出，枯草芽孢杆菌Asr最适宜接种量为10%。

2.4.4 不同搅拌转速对菌株发酵产量的影响

搅拌转速的主要作用是调节培养基溶氧量，满足枯草芽孢杆菌对氧气的需求。转速过快会造成培养基分层，对菌体产生机械损伤，造成菌体衰亡，菌体数量减少;转速过慢，溶氧量不足，培养基易形成沉淀，不利于菌体的生长和繁殖[33]。当搅拌转速达到250 r/min时，OD600值最大（见图3 d））。因此，枯草芽孢杆菌Asr的最适宜搅拌转速为250 r/min。

3 结果与讨论

枯草芽孢杆菌Asr的菌体产量与培养基成分和发酵条件有关。本研究显示，培养基成分中酵母浸粉对菌体产量的影响最大，与已有文献的研究结果一致。可能是由于酵母浸粉中含有丰富的蛋白质等营养物质，能够被菌株快速吸收，從而促进菌株的生长繁殖。在发酵工业中，接种量的大小直接影响活菌数量的增长，较大的接种量可以使菌株快速生长繁殖，增大菌株活力，但过大的接种量会使菌株过早老化，影响菌体产量[34-35]。本研究得出枯草芽孢杆菌Asr的最佳接种量为10%。

本研究采用的初始发酵培养基与大多数研究学者采用枯草芽孢杆菌发酵所用培养基成分一致[26-27]，但对枯草芽孢杆菌Asr的发酵能力偏低，因此前期试验对培养基成分中的无机盐进行了调整，作为本研究的原始发酵培养基。采用正交试验、响应面试验对既定培养基的发酵工艺进行优化，提高了枯草芽孢杆菌Asr的菌体产量;得出最佳培养基配方为蔗糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母浸粉8.65 g/L，K2HPO4 3.0 g/L，MgSO4 0.27 g/L，CaCl2 0.53 g/L;最佳培养条件为温度37 ℃、初始pH值7.0、接种量10%、搅拌转速250 r/min。应用优化配方及工艺，枯草芽孢杆菌Asr菌株最高产量可达到7.30×108 cfu/mL，菌体产量较优化前提高了3.95倍。研究结果可为后续发酵罐的扩大培养、提高菌体产量提供技术支撑，也可为其他枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化研究提供借鉴。

本研究仅在摇瓶和3 L发酵罐条件下对枯草芽孢杆菌Asr菌株的发酵工艺进行了初步探索，对该菌的产芽孢量及发酵过程中抗菌蛋白的增加量尚有待作进一步的研究。后期还需在工厂10 t发酵罐进行放大试验，逐步实现产业化生产。

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