95 份存放15 年及以上生物检材检验结果统计分析

柯永庆 邓存霞 袁 红

（东莞市公安局，广东 东莞523008）

随着DNA检验技术的不断发展，过去没有条件进行DNA检验或无法得到有效检验的现场物证，通过采取合理的提取方式和检验方法，能够进一步提高检验成功率，成为破案的关键。本文梳理统计在命案积案破案攻坚工作中存放15 年及以上的95 份生物检材DNA 检验方法和结果，以期为DNA检验在破积案方面提供参考。

1 检材与方法

1.1 检材情况

检材均为存放15年及以上的历年未破命案现场物证，大部分未进行分类和提取，物证以案件为单位装在纸皮箱中室温保存，类型和数量见表1。

1.2 检验情况

1.2.1 DNA提取

烟头、精斑、胶带直接剪取适量；方向盘、刀柄、电线采用脱落细胞粘取器［1］进行粘取；可疑血迹、瓶口、刀刃采用干湿两步法棉签擦拭提取，共95份检材。剪取提取好的适量检材装1.5mL 离心管，加细胞消化液400uL、10mg/mL 蛋白酶K 32uL，56℃温浴1h，磁珠法（长春博坤磁珠）提纯模板DNA，洗脱体积为30uL纯水。

1.2.2 PCR扩增

采 用 PowerPlex®18D System 试 剂 盒 在ABI Veriti 型扩增仪扩增，反应总体系25uL（模板DNA 15uL、Primer Pair Mix 5uL、Master Mix 5uL），扩增循环次数为30 次。上述扩增产物均在3500XL 分析仪（AB 公司，美国）进行毛细管电泳分离，使用GeneMarker Forensic V1.9软件进行数据分析。

2 结果

2.1 检验结果

检验结果依据《人类DNA 荧光标记STR 分型结果的分型及应用》（GA/T 1163-2014）相关要求，峰高大于100 相对荧光单位，检出17 个以上STR 基因座及Amelogenin 基因座标记为“检出”，检验结果见表2。

2.2 破获案件

表1 检材类型及数量

除事主外，上述检材共检出嫌疑人DNA分型4 人（分别为烟头3 人、可疑血迹1 人），比中嫌疑人3 人，破获或为命案积案提供线索3宗。

3 讨论

3.1 检验难点

受所处环境的温度、湿度、光、化学及生物等因素的作用，DNA 会发生降解，或者掺入PCR 抑制剂，存放时间越久、降解越严重。上述检材均存放在室温环境，且大部分房间并不通风，保存长达15年或以上，DNA降解非常严重，即使像血迹、烟头、精斑类的常规检材，其DNA含量或将接近于微量检材。因此，最大量的释放和提纯模板DNA，合理选择扩增反应体系和循环次数降低抑制物质和干扰峰的影响对检验结果尤其重要。

3.2 方法选择

第一，利用56℃温浴1h，磁珠法最大量的释放和提纯模板DNA。细胞消化液56℃温浴将细胞膜、核膜破坏，适当延长温浴时间有利于裂解细胞核，使DNA能更完全地释放，同时蛋白质的变性也更为彻底［2］。磁珠法提取接触DNA等微量检材灵敏度较高，提取的DNA物质分型完整，纯度高，且不含色素、蛋白质等杂质［3］，并且可以去除100bp 以下的小片段DNA，减少STR扩增时出现的小片段优势现象。

第二，合理选择扩增反应体系。扩增体系扩大，消除抑制因素能力会增强［4］。本文检材采取反应总体系25uL（模板DNA 15uL、Primer Pair Mix 5uL、Master Mix 5uL）的方式，提高了模板DNA的相对浓度，并利用大体系扩增有利于消除抑制因素的特点，有利于获得更好分型图谱。

第三，合理选择循环次数。法医学实践中，常规PCR循环数为28次，适当增加循环次数，可使DNA 合成更充分，从而提高灵敏度，已被许多人用于多种类型低拷贝检材的DNA分析。但随着循环次数的增加，STR 分型结果中易出现等位基因扩增不均衡、影子带和等位基因丢失等现象，同时实验室环境和操作污染对样本STR 分型的干扰作用变得更加明显［5］。研究显示循环数增至34 次甚至以上，获得的STR分型不稳定。微量检材DNA 含量普遍在0.1～1.5ng之间［6］。不同PCR扩增循环数的基因分型检测结果统计显示［7］，对模板量大于0.0625ng的低拷贝模板基因分型检测结果，30次循环数的检验结果优于28次，且与32次循环数及以上的检测结果持平。综上所述，本文检材采用PowerPlex®18D System 试剂盒25ul 体系 （模板15uL、Primer Pair Mix 5uL、Master Mix 5uL），30 次扩增循环次数进行PCR 扩增，获得的STR分型结果稳定、正确，且受非特异谱带与pullup峰影响小。

3.3 检材类别与检出率

血、烟头、精斑等常规生物检材由于分别含有大量的血细胞、唾液斑、精子细胞，虽受各种因素影响发生严重降解，但仍有检出的可能。从表2 可以看出，利用本方法对存放15 年及以上的血迹、烟头、精斑进行DNA检验，平均检出率为77.3%。

胶带、刀柄、电线、方向盘等检材，主要含人体皮肤表层脱落细胞，Harbison［8］统计不同载体表面接触DNA的检验成功率发现，光滑坚硬的载体表面提取接触DNA 的成功率最低。且表皮细胞离体后会产生自溶，使DNA 降解，一般72h 内自溶和降解速率影响因素较小，而超过该期限则会加快溶解速率［9］。上述检材存放时间长达15年及以上，且并未妥善保存，检出几率非常低，仅有一处刀柄检出（经比对为事主所留），经查看该刀柄存在分散血点，考虑检出的DNA分型来自刀柄上潜血，而并非皮肤表层脱落细胞。

表2 检验结果

3.4 存在不足

第一，对检材保管不重视。上述检材均存放在室温环境下，未能及时提取并保持在-20℃超低温冰箱，导致DNA降解严重。

第二，防污染意识不强。现场物证均以案件为单位将全部检材存放在同一纸皮箱中，容易造成物证之间的交叉污染。

第三，针对上述检材未进行DNA定量，缺少对模板DNA的精准定量，不利于后期经验总结和理论分析。

随着命案积案破案攻坚工作的深入开展，长期存放在物证室陈旧、不被重视的现场物证以及过去没有条件进行DNA检验或无法得到有效基因分型的现场物证，经过优化方法重新进行DNA检验，在积案的侦破过程中发挥了重要作用，并且具有广阔的研究空间，值得引起重视。