精子DNA碎片率和精液常规参数与年龄的相关性研究

陈亚强　吴成亮　邢梦雪

[摘要] 目的 分析男性不育患者年齡与精子DNA碎片率和精液常规参数的相关性。 方法 选择2018年1～12月在本院男科就诊的患者725例，按照年龄将患者分为三组。20～29岁组（n=229），30～39岁组（n=371），40～49组（n=125），采用染色质扩散（SCD）实验检测精子DNA碎片率，按照《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》（第5版）中标准检测精液常规各参数。分析精子DNA碎片率（DNA fragmentation index，DFI）和精子参数在各组的差异及年龄与精子DNA碎片率和精液参数的相关性。 结果 年龄与DFI之间存在正相关关系（r=0.273，P<0.01），与精子活力（r=-0.131，P<0.01）、精液pH（r=-0.080，P<0.05）之间存在负相关关系，与精子浓度之间的相关性差异无统计学意义。精液pH与精子浓度之间存在正相关关系（r=0.285，P<0.05）。 结论 伴随着男性年龄的增长，精子的活力会降低，并使男性的生育力下降以及对子代产生不良影响，精子DFI与精液常规各参数无相关性。故精子DNA碎片检测可作为精液常规分析的补充，进一步反映男性的生育能力。

[关键词] 男性不育;年龄;精子DNA碎片;精液常规参数

[中图分类号] R698.2          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-9701（2020）25-0033-04

A study of the correlation between age and sperm DNA fragmentation index and the routine semen parameters

CHEN Yaqiang1   WU Chengliang1   XING Mengxue2

1.Department of Assisted Reproduction， Maternal and Child Health Hospital of Jiujiang in Jiangxi Province， Jiujiang 332000， China; 2.Department of Clinical Laboratory， Maternal and Child Health Hospital of Jiujiang in Jiangxi Province， Jiujiang   332000， China

[Abstract] Objective To analyze the correlation between the age of male infertile patients and sperm DNA fragmentation index（DFI） and the routine parameters of semen. Methods 725 patients treated in Department of Andrology of our hospital from January to December 2018 were selected and divided into three groups according to their age. For the group at the age of 20-29（n=229）， the group at the age of 30-39（n=371）， and the group at the age of 40-49（n=125）， the sperm DFI was detected through sperm chromatin dispersion（SCD） test， and the various routine semen parameters were detected according to the standards in "WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen"（The 5th Edition）. The differences of sperm DFI and sperm parameters among the groups and the correlation between age and sperm DFI and the semen parameters were analyzed. Results There was a positive correlation between age and DFI（r=0.273， P<0.01）， and a negative correlation between age and sperm motility（r=-0.131， P<0.01）， age and the semen pH（r=-0.080， P<0.05）， and the difference in the correlation between age and sperm concentration was statistically insignificant. There was a positive correlation between the semen pH and sperm concentration（r=0.285， P<0.05）. Conclusion With the increase of the age of men， sperm motility may decrease， affecting male fertility. Sperm DFI has no correlation with the various routine semen parameters. Therefore， the detection of sperm DNA fragments test can be used as a supplement to routine semen analysis， further reflecting the male fertility.

[Key words] Male infertility; Age; Sperm DNA fragment; Routine semen parameters

据世界卫生组织报道，近年来不孕不育症患者增加，其中男性的比例占一半左右[1-2]，男性的年龄对生育和子代的影响越来越得到关注。有研究认为年龄与男性生育后代的儿童癌症、神经系统疾病及自闭症相关[3-5]。精液的常规检查已经不能满足临床需求，约有15%男性精液常规分析结果正常仍不育[6]。随着科学的进步，遗传物质的完整性对生物的发育影响逐渐被人们重视。精子DNA碎片率可反映遗传物质的完整性或损伤程度，精子DNA碎片率增加会导致IVF受精率下降和胚胎发育异常增加[7-10]，从而降低临床妊娠率。同时也增加子代罹患认知神经疾病、常染色体显性疾病、先天性疾病和其他疾病的风险[11]。本研究测定了725例男性患者精子DFI、精子浓度、精子活力和pH等参数，精子DFI和精液常规等多参数与年龄之间相关性分析，进而研究年龄在男性生育能力和对子代的影响方面的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2018年1～12月来我院辅助生殖不孕不育科门诊就诊的患者中725例标本，所有DNA碎片率结果的标本。标本均符合WHO实验室手册（第5版）要求的精液结果。按照年龄分成20～29岁组（n=229）、30～39岁组（n=371）、40～49组（n=125）三个组。排除标准：由支原体、衣原体、细菌等病原微生物感染所导致精子质量受到影响者;存在功能性、器质性等原因不育者;最近1个月内有使用过对精子功能产生影响的相关药物进行治疗者;且三组中无性功能障碍史者;无睾丸、附睾、输精管等生理和解剖异常问题者;无染色体缺失、重排、异位等异常及性激素紊亂者。禁欲天数都控制在2～7 d之内，精液量完整，分组具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 精液常规  所有患者均已禁欲2～7 d，以手淫法留取标本于洁净的一次性塑料容器中，液化后取4.5 μL，以江苏瑞琪CFT-9202型精子质量检测分析系统进行精液常规分析。每份标本检测两次，每次观察至少5个视野且大于200条精子。检测各组精液的精子浓度、活力PR+NR级精子百分率等参数。

1.2.2 精液pH  采用上海三爱思试剂有限公司生产精密试纸pH 5.5～9.0。

1.2.3 DFI检测  采用精子染色质扩散法SCD（Sperm chromatin dispersion），由深圳华康生物科技有限公司生产的精子DNA碎片检测试剂盒，该产品生产许可证编号：粤食药监械生产许20030802号。实验操作：①室温调整至20℃～28℃;试剂盒取出放置室温平衡30～60 min。②将低熔点琼脂糖管放入90℃～100℃水浴1～2 min至琼脂糖凝胶完全熔解，然后将管子放置于37℃水箱至温度恒定。③稀释精子密度至5×106～10×106/mL，再吸取60 μL上述已经稀释的精子溶液加到已熔解低熔点琼脂糖管中，充分混匀。冬天操作应防止琼脂糖凝固，操作应迅速。④将含有精子的低熔点琼脂糖悬浮液取出滴加到水平放置的预处理载玻片上，最好从一端缓缓盖上盖玻片，以避免产生多余气泡。⑤将带有上述琼脂的载玻片置于2℃～8℃冰箱放置4～5 min，以使低熔点琼脂糖完全凝固。从冰箱取出载玻片，移走盖玻片。⑥将处理好后的载玻片没入变性液中充分反应，取出载玻片，浸泡在蒸馏水中;之后取出载玻片使其垂直放置，用吸水纸吸干表面多余水珠，勿接触标本区域;再将载玻片浸入裂解液中准确反应20 min。⑦反应完毕后，将预处理载玻片浸入洗涤液，以除去多余裂解液。由于裂解液为有毒性物质，此反应中应做好防护，如佩戴护目镜、N95口罩、帽子等。之后取出依次浸入70%、90%、100%乙醇溶液中脱水。⑧让预处理载玻片自然晾干。⑨用瑞氏染液进行染色。将染色液A液与B液按等比倒在棕色玻璃瓶中进行混合配制。水平放置预处理载玻片，将混匀好的染液加到玻片上，使其覆盖满整块载玻片。染色后，看到表面覆盖一层金黄色薄膜时，将染色后的载玻片以蒸馏水缓缓冲洗多次以便除去多余的染液残渣。待其干燥后在40倍普通光学显微镜下观察计数。精子DNA碎片判定标准参照相关文献报道[12]。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0统计学软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，符合正态分布和方差齐性的数据，采用单因素方差分析，不符合正态分布和方差齐性的数据采用非参数秩和检验;相关性分析采用Pearson检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各年龄组间的精液多种参数与DFI的比较

将全部725例符合要求的标本纳入研究，各组精子DFI、精子浓度、精子的活力、精液pH均数和方差总结表明，单因素方差分析显示年龄与DFI、与精子活力、精液pH之间相关性差异有统计学意义（P<0.05），与精子浓度之间的相关性差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

2.2 年龄、DFI和精液参数相关性分析

年龄与精子DFI相关性分析结果显示，年龄与DFI之间存在正相关关系（r=0.273，P<0.01），与精子活力之间存在负相关关系（r=-0.131，P<0.01），与精液pH之间存在负相关关系（r=-0.080，P<0.05），与精子浓度之间的相关性差异无统计学意义。

精子DFI与精子各参数相关性分析结果表明，精子DFI与精子浓度之间存在负相关关系（r=-0.083，P<0.05），与精子活力之间存在负相关关系（r=-0.359，P<0.01），与精液pH之间存在负相关关系（r=-0.049，P<0.05）。精液pH与精子浓度之间存在正相关关系（r=0.285，P<0.01），与精子活力之间存在正相关关系（r=0.082，P<0.05）。见表2。

3 讨论

有研究表明[13-15]由于精子DNA作为遗传信息的载体，遗传信息的丢失会对自然生育或辅助生殖技术治疗结局产生不良影响，并可能导致胎停、流产、生化妊娠等不良结局。精子在产生过程中某些程序出现异常，或者机体内环境、体外环境发生改变等多种因素影响下，精子DNA均可能受到损害[16]。目前已知精子DNA损伤的因素[17-21]为：（1）精子发生过程中某些因素诱导细胞的非程序性凋亡，从而产生大量DNA结构受损的精子，并且没有得到及时清除，促使DFI升高;（2）精子易受自由基攻击和氧化，活性氧过度产生，超过精子抗氧化的防御能力极限，而体内没有足够的氧自由基抑制剂，可诱导细胞内部发生氧化应激反应损失精子DNA，细胞质膜等结构被破坏，致使DFI升高;（3）染色质包装的异常，精蛋白（P1，P2）的数量和比例异常，使得精子DNA双链不完整，引起DFI升高;（4）放射疗法和化学疗法等治疗方法引起DNA损伤;（5）环境中的微量元素、化学毒物等引起的DNA损伤，如微量元素镐、硒和一些常见的铅和铁等。（6）生活方式等，如酗酒、吸烟、外卖食品、久坐、熬夜、肥胖等不良生活方式都会导致精子DNA异常凋亡。在精子DFI目前的检测方法主要有精子染色质结构测定法（Sperm chromatin structure assay，SCSA）、SCD。有实验表明两种检测方法的均值有显著差异，而且SCD测得的精子DFI均值比SCSA较高[22]。本研究采用了SCD法检测男性患者的精子DFI，并且用相关方法对精液常规各种参数进行检测。本研究对年龄与精液各项参数进行比较，随着年龄增加，精子DFI也会增加，这与刘树沅等[23]研究结果一致。对精子DFI与精液各项参数进行比较，精子DFI与精子浓度、精子活力、精液pH呈负相关关系，精液pH与精子浓度呈正相关关系，这与袁人培等[23]、李非凡等[25]和刘依萍等[26]研究的报道相一致。本实验设计由于没有对禁欲时间进行更加详细的分类统计，可能存在一定不足，会受到禁欲天数影响。但也有研究显示[27]，禁欲时间与精子DNA完整性关系并非单纯正负相关的关系，故本实验不具体进行分析。

综上所述，通过本实验可以看出伴随着男性年龄的增长，精子的活力会降低，使男性的生育力下降并对子代产生不良影响。常规精液检查可以从精子的浓度、活力、活率和形态对男性生育力进行分析，但随着时代的进步，常规精液检查已经远远不能满足临床对男性生育力评估的需求。Jennings等[28]对是否应该因为年龄因素做胚胎植入前遗传学诊断（PreImplantation genetic diagnosis，PGD）进行了研究，并没有足够的证据支持需要做PGD，而精子DNA碎片检测可作为重要的一项检查，可以较为全面地反映男性的生育能力。有望作为一种常规检查，与精液常规、精子形态学、免疫学等相关检查一起作为进行人类辅助生殖技术治疗前的常规检测，从而为临床提供指导。

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（收稿日期：2020-05-25）