腺相关病毒介导的增强型绿色荧光蛋白基因转染豚鼠巩膜成纤维细胞的实验研究△

鲍庆东 刘太祥 罗鑫 田祥

近视是一种世界性的常见眼病，其发病率逐年递增，是全球导致视觉损害的主要原因[1]。近视发生发展的机制仍未完全清楚。研究表明，近视往往伴有眼轴延长,95%以上的近视是由眼轴的延长所致[2]，而眼轴的延长与巩膜重塑密切相关[3]，巩膜重塑涉及巩膜细胞外基质的持续合成与降解[4]。巩膜成纤维细胞(scleral fibroblasts,SF)是巩膜的固有细胞成分，既负责合成分泌胶原蛋白、弹性蛋白、糖蛋白、胶原纤维[4]，同时也负责分泌降解巩膜胶原纤维等细胞外基质的MMP-2与TIMP-2[5-6]，SF调控近视眼巩膜胶原合成、分泌，从而在巩膜重塑中发挥重要作用，通过基因转染技术对SF进行基因改造以改变其生物学特性,将有助于近视的防治,中间基因载体的选择成为关键。目前，腺相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)是眼病基因治疗的理想载体，其中AAV2、AAV5、AAV8、AAV9在视网膜疾病、角膜病、青光眼等基因治疗研究中得到了广泛的应用[7-9]，但鲜有研究论证AAV载体介导外源基因转染SF的转染率及安全性。本课题拟将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因作为目的基因，通过AAV2、AAV5、AAV8、AAV9四种病毒载体,按照不同感染复数(multiplicity of infection，MOI)介导EGFP基因转染体外培养的豚鼠巩膜成纤维细胞(guinea pig scleral fibroblast,GSF)，观察AAV作为载体介导EGFP基因转染GSF的转染效率和安全性,找到适合SF基因治疗的基因载体。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂健康三色2周龄豚鼠8只，雌雄不限，由重庆市塑山区腾鑫养殖场提供[SCXK(渝)2017-0010]。AAV2-CMV-EGFP、AAV5-CMV-EGFP、AAV8-CMV-EGFP、AAV9-CMV-EGFP(上海汉恒生物公司)，DMEM培养基、胎牛血清(美国Gibco公司)，Vimentin一抗、Dnk anti-rabbit FITC荧光二抗(英国Abcam公司)，CCK-8试剂盒(上海碧云天生物科技公司)。本研究已通过遵义医科大学附属医院伦理委员会审批同意[编号：KLLY2018-082]。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与鉴定将豚鼠断头处死，无菌条件下摘除豚鼠双眼球，修剪多余球周组织，取后极部巩膜组织，将后极部巩膜剪成1 mm×1 mm大小，接种到含体积分数10%胎牛血清的DMEM高糖培养液中培养，待细胞生长融合后按12 传代。取第2代细胞，经细胞免疫荧光法进行细胞鉴定后作为实验对象。

1.2.2 细胞转染将GSF传代于细胞培养板上，培养24 h后待转染细胞约为每孔5×106个，用 PBS液分别将 AAV2-EGFP、AAV5-EGFP、AAV8-EGFP、AAV9-EGFP稀释，再分别按 MOI为10、100、1000、10 000 进行转染，以未进行病毒转染的细胞(MOI=0)作为空白对照组，各设2个复孔。转染后每天观察细胞形态，于转染后2 d、3 d、4 d和5 d在倒置荧光显微镜光下观察GSF中EGFP的表达情况。

1.2.3 流式细胞术检测基因转染率取MOI=10 000、感染后5 d细胞，胰蛋白酶消化，离心收集细胞，加入 PBS 制成细胞悬液，流式细胞仪分析细胞转染率。

1.2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率按1.2.3方法制成细胞悬液，计数100×103个细胞放入100 μL结合缓冲液，Annexin V 5 μL先孵育20 min，室温避光，加入结合缓冲液400 μL,使用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.5 CCK-8法检测细胞活力取MOI=10 000、感染后5 d细胞，缓慢向培养板上每孔加入10 μL CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育1 h，用酶标仪测定在450 nm波长处的光密度(D)值。

1.3 统计学分析采用SPSS 18.0 统计学软件进行统计分析，使用Graphpad Prism 8绘图，本研究测量指标的数据经Kolmogorov-Smirnov检验呈正态分布，以均数±标准差表示，各组间比较采用单因素方差分析，组间均数经Levene检验方差齐，采用LSD法进行两两比较，检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 细胞培养和鉴定原代GSF培养4～5 d 后细胞开始从组织块边缘部长出，14 d 左右可融合70%，大多数细胞呈梭形，部分呈不规则三角形、多角形等，细胞密度较低时交织呈网状，细胞密度较高时融合呈束状，传代后细胞生长速度明显比原代细胞变快。细胞免疫荧光染色结果显示：GSF呈梭形，细胞浆中波形蛋白(Vimentin)表达呈亮绿色，细胞核呈圆形，DAPI染色后呈亮蓝色(见图1)。

图1 原代培养的GSF及免疫荧光染色结果(标尺=50 μm) A:GSF原代培养5 d(×100);B:GSF原代培养14 d(×100);C:波形蛋白(Vimentin)表达呈亮绿色，DAPI染色细胞核呈亮蓝色(×100)

2.2 转染后各组荧光表达EGFP基因转染GSF后2 d各转染组均可见弱荧光，在AAV2-EGFP组、AAV5-EGFP组和AAV8-EGFP组中，荧光强度随感染时间延长及MOI值变大而增强；转染后5 d、MOI=10 000时荧光强度最强。EGFP在细胞中表达呈绿色，弥漫整个细胞核和细胞质，AAV8-EGFP组荧光强度明显强于AAV2-EGFP组与AAV5-EGFP组(见图2-图4)。AAV9-EGFP组在各时间点及各MOI值时均为微弱荧光。空白对照组全程未见荧光。基因转染后每天显微镜下观察细胞生长状态良好，未见细胞脱壁及肿胀变形。

图2 AAV2-EGFP组转染后不同时间荧光表达情况(×100)

图3 AAV5-EGFP组转染后不同时间荧光表达情况(×100)

图4 AAV8-EGFP组转染后不同时间荧光表达情况(×100)

2.3 流式细胞术检测基因转染率荧光显微镜观察结果显示：当MOI=10 000时，基因转染后5 d EGFP表达最强。流式细胞术检测基因转染率各组间整体比较，差异有统计学意义(P<0.05)；进一步两两比较，AAV8-EGFP组转染率均高于其他各组，差异均有统计学意义(均为P<0.05)(见表1)。

表1 流式细胞术检测基因转染率

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡率基因转染后5 d，MOI=10 000时，流式细胞术检测细胞Annexin V阳性凋亡率各组间整体比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表2)。

表2 流式细胞术检测细胞凋亡率

2.5 CCK-8法检测细胞活力基因转染后5 d，MOI=10 000时，采用酶标仪测定GSF在450 nm波长处D值，各组间整体比较，差异无统计学意义(P>0.05)(见表3)。

表3 酶标仪检测GSF在450 nm波长处D值

3 讨论

基因治疗是一种“分子治疗”技术，将有治疗作用的DNA、mRNA、siRNA、microRNA等通过载体导入人体靶细胞，通过基因置换、修复、修饰、失活等方式发挥治疗作用。AAV载体是基因转染研究的重要载体，具有独特优势[10-12]：(1)安全性高，ITR序列和rep/cap 基因分别由独立的质粒表达，对人体无致病性;(2)宿主范围广，能转染分裂细胞和非分裂细胞；(3)化学性质稳定，容易保存，便于实验操作，在多种无机和有机溶剂中保持稳定。

本研究中，AAV2-EGFP、AAV5-EGFP、AAV8-EGFP感染GSF后5 d内荧光强度随时间延长及MOI值增大而明显增强，直至基因转染5 d、MOI=10 000 时，绿色荧光表达最强，此时AAV8-EGFP组转染率可高达(74.867±4.601)%。张兰兰等[13]利用慢病毒介导GFP基因转染GSF，转染后 5 d、MOI=400时，转染率可达82.86%。相比而言，AAV感染GSF的能力明显弱于慢病毒。AAV9-EGFP组转染5 d内均为弱表达，荧光表达最强时转染率仅为(4.650±0.205)%，在AAV感染宿主过程中，AAV先与靶细胞表面的糖化受体相结合，通过网格蛋白进入靶细胞[14]，进入细胞后AAV衣壳上VP1/VP2结构会发生改变，从核孔进入宿主细胞中的细胞核进行转录与翻译[15-16]。AAV9与AAV2、AAV5、AAV8基因组是相似的，主要区别在于蛋白衣壳，因此，我们推测AAV9低感染率可能是由病毒外壳与GSF表面的糖化受体相结合能力弱所致，而AAV8与GSF表面的受体结合能力最强。另外，由于GSF表面糖化受体数量有限，如果继续延长转染时间，结合达到饱和，转染率可能由低到高最后趋于稳定。本实验中流式细胞术、CCK-8法检测的结果表明，四种AAV载体介导EGFP基因转染GSF对细胞凋亡及细胞活力无明显影响，AAV介导外源基因转染离体细胞高安全性的结果与其他研究结果基本一致[17-18]。

筛选载体是基因治疗研究的重要步骤，也是后续目的基因转染及基因表达检测的前提，是缩短实验准备时间，提高科研效率的关键。本实验采用EGFP作为目的基因，证实了AAV2、AAV5、AAV8、AAV9对GSF的凋亡及细胞活力无明显影响，其中，AAV8载体能更加稳定有效地转染至GSF。这为后期我们采用AVV8载体对近视眼进行基因防治打下基础。另外，本研究仅限于早期离体细胞水平层次，对于基因转染对SF的远期影响及动物在体转染实验有待进一步研究探讨。