福建尤溪烟叶香韵风格的感官辅助凝胶色谱分析

茅中一 ，周培琛，章雪锋，张峰，洪祖灿，张晓兵，谢金栋

1 福建中烟工业有限责任公司技术中心，福建省厦门市集美区滨水路298号 361021；

2 厦门大学化学化工学院化学系，福建省厦门市思明南路422号 361005；

3 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2号 450001

烟叶致香成分是影响烟叶香型风格质量感官评价的重要因素，研究烟叶中致香成分对于揭示烟叶风格质量的形成原因具有重要意义[1]。对于烟叶致香成分的研究以往大多是未经分离直接进行的全面分析[2]，而经分离再分析的报道较少。上世纪80 年代冼可法等[3]采用多种分离、分析技术耦合研究云南烟叶中性香味物质，并重组出具有似云烟香的分离组合物，此研究拓宽了分析香型风格及其所含致香成分的思路。

近些年分离、分析新技术发展迅速，在烟叶致香成分分析领域得到了广泛使用。如凝胶色谱分离法（GPC）在烟叶关键香味成分的感官导向分析已有应用[4-5]，全二维气相色谱-飞行时间质谱（GC×GC-TOF MS）也应用于烟叶致香成分的分析[6]。虽然已有对烟叶致香成分经分离再分析的相关报道[3]，但所用的分离、分析方法均较为传统，且未与感官评价相结合。目前基于感官辅助GPC 耦合GC×GC-TOF MS 法对烟叶香韵风格及其致香成分分析还鲜有报道。因此，本文以福建尤溪烟叶浸膏为研究对象，采用GPC 分组分离，结合感官评价结果筛选关键香韵特征组分，并借助GC×GC-TOF MS 进行定性分析，以期为烟叶香韵风格及其重要致香成分的分析提供新的方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

材料：福建尤溪YLC01-2016 烟叶、“七匹狼”参比卷烟（福建中烟工业有限责任公司提供）。

试剂：95%乙醇、无水乙醇、乙酸乙酯、正己烷、二氯甲烷（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司），氘代萘、氘代蒽（≥98%，北京百灵威科技有限公司），Sephadex LH-20 填料（美国GE 公司）。

1.2 仪器与设备

LECO Pegasus 4D 全二维气相色谱-飞行时间质谱联用仪（美国Leco 公司）；GFL1041 恒温水浴锅（德国GFL 公司）；Hei-VAP Precision ML 旋转蒸发仪（德国Heidolph 公司）；MP200 中低压制备色谱（天津博纳艾杰尔科技有限公司）；玻璃层析柱（2.6 cm×100 cm）（瑞士Buchi 公司）；CMB120 自动香精香料注射器（意大利G.D.SOCIETA PER AZIONI公司）；AT261 变量程电子天平（瑞士Mettler 公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取浓缩方法

取100 g 烟叶，采用1000 g、95%乙醇提取，水浴温度控制在80℃，提取时间1 h，提取次数2 次。合并两次所得烟叶提取液，经减压蒸馏浓缩3 h（体系压力5～14 kPa，水浴温度50℃），得到棕褐色的粘稠液体，冷却后得到浸膏。

1.3.2 分离方法

将4 g 选定的烟叶浸膏溶解于6 mL 无水乙醇中，充分震荡后过滤，过滤后的样品进行GPC 分离，柱填料为Sephadex LH-20（填料填充柱长80 cm），以无水乙醇作为流动相，按流速4 mL/min 洗脱，每3 min 收集一个流份。

1.3.3 致香成分的检测

将目标组分分别减压浓缩至1.5 mL，加入90 μL氘代萘和氘代蒽作为内标（质量浓度分别为105.24 μg/mL、83.84 μg/mL），采用GC×GC-TOF MS 检测，仪器条件如下。

色谱分析条件。色谱柱一：HP-5MS（60 m×0.25 mm，0.25 μm）； 色 谱 柱 二：DB-l7（2.3 m×0.1 mm，0.1 μm）；柱温程序：50℃（1 min）→3℃/min →220℃→2℃/min →260℃（10 min）；载气：He；载气控制方式：恒流，1 mL/min；进样口温度：280℃；调制周期：5 s；进样量：1 μL；分流模式：分流进样，分流比10 : 1。

质谱条件。离子化方式：EI；离子源温度：230℃；传输线温度：260℃；EI 电离能量：70 eV；溶剂延迟时间：7 min；扫描模式：全扫描；质量扫描范围：45～450 amu。谱库检索采用NIST库进行检索，从检索结果中挑选正向、反向检索匹配度均大于80%的致香成分。

1.3.4 感官评价方法

由福建中烟技术中心10 名具有省级及省级以上卷烟感官评价资格的评委进行感官评价。嗅辨评价方法参考卷烟中式卷烟风格感官评价方法[7]中嗅香评价方法，对所收集到的流份进行嗅觉特征评价，仅做描述性评价。感官评吸方法为用CMB120 自动香精注射器将样品按0.01%的比例均匀添加入“七匹狼”参比卷烟中，得到的烟支置于（22±1）℃和RH（60±2）%环境中平衡48 h，参照YC/T 530—2015 烤烟烟叶质量风格特色感官评价方法[8]对参比卷烟及添加了样品的卷烟进行对比评吸。

2 结果与分析

2.1 感官评价辅助GPC 分组分离

对方法1.3.1所得浸膏按方法1.3.2进行GPC分离，共得到32 个流份，由感官评价人员逐一进行嗅辨评价得到相应的香韵特征，将香韵表现接近的流份合并成7 个组分，各组分再进行嗅辨评价得出评价结果，见表1。其中组分1、7 无明显的嗅觉特征；组分2～6所表现出的香韵特征各不相同，组分2 的香韵特征是以强烈的清甜香、青滋香为主，带有花香，干草香，组分3 的头香是花香、酮甜为主，底部能嗅辩出强烈的干草香，组分4 仍能嗅辩出组分3 的干草香、花香，但从香势上已减弱，同时底部出现了新香韵特征（焦甜香），与组分4、6 的焦甜香相比，组分5 能嗅辩出更明显的焦甜香。

表1 各流份按嗅辨评价结果分组情况Tab. 1 The flow was grouped according to the results of sensory evaluation

2.2 组分重组实验

为验证GPC 分离后各组分的香韵可重组性，对除无明显嗅觉特征的组分1、7 外的组分2～6 进行重组实验，并与浸膏样品相比较。由表2 可知，简单的一两个组分重组无法还原浸膏样品的香韵风格；组合3的清甜、蜜甜、干草香与浸膏样品有一定相似，但从整体来看香韵有缺失；组合4、5 与浸膏样品的相似程度很高，且两组合间嗅辨出的香韵特征差异不大；组合3、4、5能不同程度地反映了浸膏样品的香韵特征。

为进一步考察组合后评吸时香韵的变化，对组合3、4、5 进行卷烟加香实验，并与原烟叶浸膏做对比。由图1 可得，组合3 在清甜、蜜甜、干草香韵能基本与浸膏样品相符，但在焦甜香和辛香上有一定损失；组合4、5 的香韵表现很接近，能反映出福建尤溪烟叶的主体香韵特征，但在清甜香上与浸膏样品仍有一定程度的偏差，同时侧面说明了组分6 对组合5 的整体香韵贡献度很低。

表2 各组合与浸膏样品的香韵特征比较结果Tab. 2 Comparison of aroma characteristics between different combinations and extract

图1 组合3～5 与烟叶浸膏的主要香韵特征评分标度值对比Fig. 1 Comparison of scale values of major aroma characteristic between combination 3～5 and tobacco leaf extract

综上所述，可根据实验结果从GPC 分离所得的7个组分中确定组分2～5 作为浸膏样品的关键香韵特征组分。

2.3 全二维气相色谱-质谱联用法分析组分2～5致香成分

图2 组分2～5 各香韵重要致香成分含量分布对比Fig. 2 Comparison of content distribution of important aroma components in group 2～5

通过GC×GC-TOF MS 对组分2～5 的致香成分进行定性分析，其所鉴定出的重要致香成分及其香气特征如表3 所示，其中香气特征描述和香韵分类方式主要参考《烟草香原料》《日用调香术》等文献[9-11]。组分2、3 中大部分致香成分都带有清香、青滋香、果香、花香特征，带有焦甜香、辛香特征的种类和含量都极少。例如组分2 中含有6-甲基-5-庚烯-2-酮、茄酮、香叶基丙酮、二氢猕猴桃内酯、巨豆三烯酮、新植二烯等重要清香特征成分；反，反-2，4-己二烯醛、顺-3-己烯醛等重要青滋香特征成分；苯乙醇、β-突厥烯酮等重要花香特征成分。与组分2相比，组分3 中清香成分种类明显减少，且除了二氢猕猴桃内酯，巨豆三烯酮A-D 含量显著增大外，大部分清香特征成分含量显著下降；青滋香和果香特征成分种类和含量明显减少；花香特征成分虽然种类有所减少，但β-紫罗兰酮含量增大，其香气阈值极低[12]，反而花香更为凸显。与组分3 相比，组分4 的清香、青滋香、果香、花香特征成分种类和含量均大幅减少，另出现了蜜甜香特征成分如乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯以及一些焦甜香特征成分。组分5 中基本不含清香、青滋香、果香、蜜甜香和花香特征成分，焦甜香特征成分的种类和含量较组分4 均增多；辛香特征成分4-乙烯基愈创木酚以及豆香特征成分如γ-丁内酯、香豆素的含量也大大提高。

从图2 可更直观的看出组分2～5 各香韵重要致香成分的含量分布变化趋势。其中清香、青滋香和果香特征成分主要集中在组分2 中，分别占其总含量的78.5%、97.5%和80.6%，与其嗅辨评价结果中强烈的清甜香和青滋香为主相符；花香特征成分主要集中在组分2、3 中，分别占花香成分总含量的43.9%、44.8%，其种类和含量相近，福建尤溪烟叶最主要香韵特征成分都集中在组分2～3 中。焦甜香和辛香特征

成分主要富集在组分4 和5 中，且组分5 的焦甜香特征成分种类和总含量较组分4 显著增多，这也与组分5 能嗅辨出更明显的焦甜香相符。综上分析结果能与嗅辨评价结果相互印证，说明此感官辅助GPC 分离分析方法能不同程度将香韵特征成分有效分组分离集中并分析出重要致香成分。

表3 GC×GC-TOF MS 分析组分2～5 中重要致香成分Tab. 3 Analysis of important aroma components in groups 2～5 by GC×GC-TOF MS μg/g

3 结论

本文采用感官辅助凝胶色谱法与GC×GC-TOF MS 法联用分离分析出福建尤溪烟叶香韵风格及其所含的重要致香成分。烟叶提取物经感官辅助GPC 分离，能将制备出的流份按香韵特征分为7 个组分，并从中筛选出4 个对香韵风格贡献度大的关键组分，且能按清甜香、干草香和焦甜香等香韵区分开，较好的反映出福建尤溪烟叶干草香、清甜香突出，蜜甜香明显，花香微显的香韵风格。进一步地分析各关键组分香韵特征成分，能与文献[11,13]中所筛查出的烟叶或烟气香韵特征成分相互印证，且所含香韵特征成分及含量分布与其感官评价结果吻合。