江西首例禽戊型肝炎的诊断

李海琴，康昭风

(江西省农业科学院畜牧兽医研究所，江西南昌330200）

戊型肝炎(Hepatitis E,HE) 是由戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)引起的以肠道传播为主的传染性疾病。该病也称为大肝大脾病（Big liver and spleen disease, BLS） 或肝炎脾大综合症（hepatitis-splenomegaly,HS），1988年，鸡BLS 在澳大利亚就已经被描述报道，几乎在同一时间，加拿大和美国也有类似该病临床症状的HS 综合症疾病的报道，一直到1999年Payne 等研究者才从患有BLS的病鸡中分离获得了BLS 病毒（BLS virus,BLSV），并通过一小段病毒的核酸序列分析发现，该序列与戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus, HEV）的核酸序列有着较高的同源性。2001年，Haqshenas 等从患有HS 综合症的病鸡中分离获得了该病毒并命名为禽HEV，通过序列分析发现，BLSV 与禽HEV 可能是同一病毒的不同变异株[1]。

在我国，1994年单松华等利用琼扩试验证实了BLSV 抗体在我国鸡群中的存在，2005年马玉玲等利用RT-PCR 方法从南京某鸡场扩增获得了一小段BLSV 的核酸序列，但是并没有后续的相关报道[2]。近几年在我国多个省份报道了本病的发生[3]。资料显示，致病型禽戊型肝炎病毒主要危害成年母鸡，综合致死率不高；而非致病型禽戊型肝炎病毒毒株可在某些健康鸡群中长期存在[4]。但近年来，我国多个大型鸡场出现了严重的肝破裂出血综合征，其发病时间以17 周龄为主，其临床多表现为鸡冠苍白、精神沉郁、腹泻、肛门周围羽毛被污染或有糊状粪便。HEV 感染导致成年鸡死淘率大幅提高并严重影响产蛋，给养禽业造成了巨大的经济损失。

HEV 最早通过免疫电镜观察推断为小RNA 病毒[5]，在2001年，由于该病毒形态与杯状病毒类似，Kabrane 等将其归为嵌杯病毒科[6]。病毒呈不规则的球状，无外膜，属于正链、单股RNA 病毒[7]；病毒颗粒有60 个亚单位，其亚单位结构呈凹形或六铃体。病毒内部有致密和透亮两种形态，分别为完整和不完整的病毒颗粒。病毒对温度抵抗力较弱，在低温时不稳定，4℃下容易裂解，反复冻融易导致病毒丧失部分生物学活性，在液氮中可长期保存，该病毒可被含碘化物的消毒剂杀死，对酸和碱有抵抗力。

最近江西某规模蛋鸡场发生疑似禽戊型肝炎感染的病例，经临床诊断及实验室的诊断，确诊为禽戊型肝炎感染。

1 临床症状与剖检病变

江西抚州市某规模化蛋鸡场饲养的品种为罗曼褐蛋鸡，2020年4月上旬17 周龄鸡开始陆续出现鸡冠苍白、萎缩，肛门周围羽毛被粪便污染，脚垫水肿等症状的鸡只，至24 周龄时正常产蛋率应该达到90%以上，但这些蛋鸡的产蛋率只有70%左右，期间用了多种抗生素治疗基本无效，濒死鸡消瘦，鸡冠发育不良或萎缩，日死亡率在0.2%左右。剖检病死鸡，临床病变主要表现为鸡冠苍白萎缩，肛门周围有粪污，肝脏肿大、出血，有的肝破裂、被膜下有血凝块，脾肿大，有的肝脏出现绿肝，卵巢发育不良，萎缩。其他器官剖检未见明显病变，见图1。

图1 病死鸡临床剖检图

2 实验室诊断

2.1 病理切片分析

无菌采集病死鸡的心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、气管、食道、十二指肠等组织样品，置于4%多聚甲醛溶液内固定，进行石蜡包埋、切片制作、HE 染色、切片成像和组织病理学检查分析,结果见图2。

注：A：肝组织广泛可见淀粉样变，大量肝窦及血管淤血。B：脾组织白髓结构消失，红髓淋巴细胞排列较疏松，局部可见小灶性坏死，胞核溶解，呈嗜酸性均质状。

2.2 套式RT-PCR 检测

2.2.1 样品采集与处理。无菌采集病、死鸡的新鲜肝脏、脾脏分别置于1.5mL 离心管中，冰上充分剪碎，加入无菌PBS 溶液200μL，颠倒混匀，上述病料悬液用低温离心机12000r/min，离心2min，离心结束后，取上清液150μL；另取胆汁样品150μL 进行下一步试验。

2.2.2 RNA 提取及反转录。按照RNA 提取试剂盒说明书对上述150μL 的不同样品进行统一的处理并提取其RNA，获得RNA 产物后利用RNA 反转录试剂盒，用通用引物进行反转录。

2.2.3 PCR 扩增。以获得的cDNA 产物为模板，利用设计的套式PCR 外用引物进行1 轮PCR 扩增，同时设置阴性对照；以1 轮PCR 产物为模板，利用设计的套式PCR 内用引物进行2 轮PCR 扩增，同时设置阴性对照和阳性对照。

2.2.4 PCR 产物纯化、测序。所有PCR 产物进行凝胶电泳，将符合目的片段大小242bp(见图3)的条带切胶、通过凝胶带纯化试剂盒纯化PCR 产物，并将其克隆到PMD18T 载体中，然后进行测序分析。

图3 电泳图

3 诊断

通过病史调查、临床症状和剖检变化，初步诊断为禽戊肝感染。组织样品病理切片结果显示肝脏淀粉样变，肝脏和脾脏严重出血，而其他器官未发现明显组织变化；套式RT-PCR 结果显示出现242bp 的目的条带，而阴性对照没有相应条带；序列同源性分析结果显示分离株与我国目前流行的几个HEV 毒株最高同源性为98.3%。因此，上述病例可以确诊为HEV 感染。这也是江西首次对禽戊型肝炎病例的确诊。

4 防控

对于禽戊型肝炎病毒的防控要从多方面努力，而不要只关注用什么药，有什么疫苗。目前世界范围内还没有商品化禽戊型肝炎病毒疫苗。除了疫苗，很多措施目前在生产中被发现是有效的，比如，有专家发现中药和微生态制剂对于降低禽戊型肝炎病毒感染的危害是有作用的，抗病毒药的使用或干扰素的使用可以降低发病率和死亡率，并缩短病程。另外，有研究发现HEV 感染会造成循环系统受阻，病鸡出现脚垫水肿、胆汁回流等症状，因此减少应激应该作为防控禽戊肝防控的第一要素。在这些基础上，有条件的鸡场应始终把加强养殖场疫病净化清除病原作为一个很重要的前提。

鸡场执行严格的生物安全措施能够限制病毒的传播。坚持对环境的消毒工作，特别是带鸡消毒，使用碘制剂和戊二醛制剂交替使用较好；及早发现，如果发现有戊型肝炎发病，除加强消毒外，还要及早淘汰患鸡，尽量减少传播机会。因为戊型肝炎可以垂直传播，所以，进苗时应调查种鸡场是否发生过戊型肝炎，严格选择鸡苗来源场，防止垂直传播。此外，鸡场应控制好免疫抑制性疾病，有报道HEV 与鸡马立克氏病毒混合感染会加剧肝肿大和破裂，当受到免疫等应激时更容易出现集中死亡。禽戊肝病毒感染带毒和发病受到很多其它诱发因素的影响，因此应该把这些问题系统解决，多方位防控HEV 的发生和感染。