脐橙渣发酵饲料固态发酵工艺的研究

张强，金恒，吴丽娟，谢乔，刘瑞平，王利华，苏州，钟云平，邱光忠

（1.赣州市畜牧研究所，江西赣州341401；2.赣州市农业农村局）

赣南作为全国最大的脐橙主产区，被誉为“世界橙乡”，2019年脐橙种植面积达10.8 万hm2，总产量122 万t，产值129 亿元。赣南脐橙深加工后副产物脐橙渣的营养较为丰富，其碳水化合物和钙含量较高，氨基酸组分较全面，粗蛋白质、粗脂肪和磷含量偏低[1]。通过一定工艺提高脐橙渣的蛋白含量，可提升脐橙渣的营养价值。宋睿等[2]利用响应面法研究冰糖橙皮固态发酵生产菌体蛋白技术，冰糖橙皮真蛋白含量由19.93%提高到23.85% 。陈卓男[1]、Crosswhite[3]和Noh[4]在育肥猪日粮中分别添加赣南脐橙皮、青贮柑橘渣、发酵柑橘渣等成分，发现均能显著提高肥育猪的饲料转化率。另外，饲料微生物具有维护畜禽肠道微生态平衡、增强机体免疫力的功能[5～6]。因此，将脐橙渣开发成益生菌发酵饲料，即可增加植物蛋白饲料来源，又能增强动物免疫力，促进畜牧行业可持续健康发展。目前，关于脐橙渣制作生物发酵饲料的文献报道较少。本试验研究了麸皮添加比例、菌种、尿素和磷酸二氢钾对脐橙渣发酵饲料的蛋白含量的影响，旨在提高脐橙渣发酵饲料的真蛋白含量。

1 材料与方法

1.1 原料与菌种

脐橙渣：含水量约12%，购置于青岛科奈尔农产品有限公司；麸皮、尿素：市售；碳酸钙：天津市北辰方正试剂厂，分析纯；磷酸二氢钾：天津市致远化学试剂有限公司，分析纯。

安琪高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；乳酸菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌：河南君安生物科技有限公司；产朊假丝酵母：无锡拜弗德生物科技有限公司；黑曲霉：济宁玉园生物科技有限公司；纤维素酶：济南天天香有限公司。以上菌种和酶均为细颗粒或粉末形态。

1.2 主要试剂及仪器

试剂：浓硫酸、硫酸铜、氢氧化钠：西陇化工股份有限公司，分析纯；硫酸钾：中国医药上海化学试剂公司，分析纯。

仪器：LAC-5080S 高压灭菌锅：上海博讯仪器仪表有限公司；粉碎机：河北金琦机械厂；GZX-GF101-3-BS-Ⅱ电热恒温鼓风干燥箱：上海跃进医疗器械有限公司；FA2004 电子天平：上海上平仪器有限公司；250 mL 凯氏烧瓶：蜀牛；半微量定氮蒸馏器：上海昕沪实验设备有限公司；DK-98-Ⅱ电炉：天津市泰斯特仪器有限公司。

1.3 试验方案

1.3.1 麸皮添加比例试验。本试验的固态发酵培养基配方包含：2%尿素，1%碳酸钙，36.79%水，0.1%安琪酵母，0.1%乳酸菌，0.01%纤维素酶，以及麸皮和脐橙渣。各试验组配方中麸皮和脐橙渣的含量，见表1。

表1 麸皮添加比例试验配方中麸皮和脐橙渣的百分含量 %

1.3.2 不同菌种试验。本试验的固态发酵培养基配方包含：54%脐橙渣，6%麸皮，2%尿素，1%碳酸钙，以及菌种和水。各试验组配方中菌种和水的含量，见表2。

表2 不同菌种试验配方中菌种的添加种类与百分含量 %

1.3.3 尿素浓度试验。本试验的固态发酵培养基配方包含：54%脐橙渣，6%麸皮，1%碳酸钙，0.1%安琪酵母，0.1%乳酸菌，0.01%纤维素酶，以及尿素和水。各试验组配方中尿素和水的含量，见表3。

表3 尿素浓度试验配方中尿素的添加浓度 %

1.3.4 磷酸二氢钾浓度试验。本试验的固态发酵培养基配方包含：54%脐橙渣，6%麸皮，2%尿素，1%碳酸钙，0.1%安琪酵母，0.1%乳酸菌，0.01%纤维素酶，以及磷酸二氢钾和水。各试验组配方中磷酸二氢钾和水的含量，见表4。

表4 磷酸二氢钾浓度试验配方中磷酸二氢钾的添加浓度 %

1.4 操作方法

配制含菌剂的固态发酵培养基，30±1 ℃下发酵3 d，将发酵产物烘干（温度102℃），粉碎，进行真蛋白含量测定，每个处理3 次平行试验。

1.5 真蛋白含量测定

将样品加入蒸馏水中煮沸，依次加入过量的硫酸铜水溶液、氢氧化钠溶液。在一定碱性条件下，蛋白质被氢氧化铜沉淀，用水洗去水溶性含氮物，沉淀部分按粗蛋白的测定方法测定其含氮量[7]。

1.6 数据处理

采用SPSS 17.0 软件对所得数据进行统计分析，试验结果以平均值±标准偏差表示，多重比较采用Duncan 新复极差法分析，P＜0.05 为有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 麸皮添加比例试验

本试验研究麸皮添加比例对发酵产物真蛋白含量的影响。

图1 麸皮添加比例对脐橙渣发酵饲料真蛋白含量的影响

结果显示，发酵3 d 后，2 组和3 组的真蛋白含量提高较显著（P＜0.05），相对于自身未发酵的样品，真蛋白分别提高了7.69%、11.37%。为更好的了解脐橙渣的发酵特性，本试验选取辅料配比更低的组合进行研究，故优化后的麸皮添加比例是6%（脐橙渣添加比例是54%）。

2.2 不同菌种试验

本试验将安琪酵母与不同菌种配合来发酵脐橙渣饲料，考察不同菌种组合对发酵产物真蛋白含量的影响。

图2 不同菌种对脐橙渣发酵饲料真蛋白含量的影响

结果显示，6 个试验组的真蛋白含量，与对照组相比有显著提升（P＜0.05）。1 组、2 组、3 组、4 组之间的真蛋白含量无显著差异（P＞0.05）；1 组、2 组、3组、4 组的真蛋白含量，比5 组、6 组的更高，且差异显著（P＜0.05）。以上说明，1 组、2 组、3 组、4 组是较优的菌种或菌种组合。由于乳酸菌具有较多的优良特性，如潘小梅等[8]利用乳酸菌产生果胶酶等水解酶，降低柑橘皮渣中抗营养物质含量。且乳酸菌应用广泛，具有保护动物（人体）肠道、提高机体免疫力等功效，所以采用安琪酵母与乳酸菌双菌组合的方案对脐橙渣饲料进行微生物发酵。

2.3 尿素浓度试验

本试验以尿素为无机氮源，配置成0%、1%、2%和3%等4 种尿素添加比例的脐橙渣发酵培养基，研究不同浓度的尿素对脐橙渣发酵饲料真蛋白含量的影响。

结果显示，发酵3 d 后，3 个试验组的真蛋白含量与对照组相比，均有显著提升（P＜0.05）。其中，2组（添加2%尿素）的真蛋白含量约为7.06%，比对照组提高了9.29%；3 组（添加3%尿素）的真蛋白含量约为6.97%，比对照组提高了7.89%。说明添加2%尿素是该固态发酵培养基配方中尿素的较优添加浓度。

图3 尿素浓度对脐橙渣发酵饲料真蛋白含量的影响

2.4 磷酸二氢钾浓度试验

本试验研究不同浓度的磷酸二氢钾对脐橙渣发酵饲料真蛋白含量的影响。

图4 磷酸二氢钾浓度对脐橙渣发酵饲料真蛋白含量的影响

结果显示，发酵3 d 后，3 个试验组的真蛋白含量与对照组相比，均无显著差异（P＞0.05），可能原因是辅料麸皮中磷源含量丰富。1 组的真蛋白含量是7.21%，与对照组（7.03%）相比提高了2.56%；3组的真蛋白含量是6.91%，略低于对照组。以上试验结果说明，在配方中添加0.1%磷酸二氢钾对脐橙渣发酵饲料真蛋白的合成起到一定的促进作用。

进一步检测发现，1 组的真蛋白含量（7.21%）与其本身未发酵的样品（6.34%）对比提高了13.72%。经过对脐橙渣发酵饲料的固态发酵工艺进行优化，脐橙渣饲料的真蛋白含量获得较大的提升。

3 讨论

3.1 麸皮添加比例试验

6%麸皮是脐橙渣发酵饲料较优的辅料添加比例。如果麸皮添加比例过高，那么微生物将更多的利用有机氮源麸皮，由无机氮源尿素合成蛋白质的量则减少，产物中真蛋白含量提高不显著。曾柏全等[9]进行了类似的研究，采用15%麸皮作为固态发酵冰糖脐橙皮渣培养基最优辅料浓度。

3.2 不同菌种试验

确定采用安琪酵母与乳酸菌双菌组合方案发酵脐橙渣饲料。酵母菌是高产蛋白菌种，本试验中乳酸菌与安琪酵母组合发酵产物真蛋白含量较高，说明可用乳酸菌和安琪酵母组合发酵脐橙渣饲料。在柑橘皮渣文献中也有菌种组合发酵的研究，如：程锦等[10]研究确定采用米曲霉/康宁木霉/热带假丝酵母三菌组合方案且比例为1:2:2 时，柑橘皮渣发酵产物中粗蛋白最高。

3.3 尿素浓度试验

添加2%尿素可使脐橙渣发酵饲料的真蛋白含量获得大幅提升。一般微生物适宜的碳氮比是25:1，本文添加2%尿素培养基的碳氮比接近25:1，较适合微生物生长。

3.4 磷酸二氢钾浓度试验

0.1%磷酸二氢钾是脐橙渣发酵饲料优化的磷源添加比例。脐橙渣中磷源含量（0.22%）较低，添加适宜的磷酸二氢钾能促进脐橙渣饲料菌体蛋白合成。类似文献[11]报道，10 g 发酵底物（不包括水含量）中添加0.04 g 磷酸二氢钾，蛋白质产量较高，且添加量在0.04～0.06 g 范围时，蛋白质产量呈负相关。

4 结论

通过研究麸皮添加比例、菌种、尿素和磷酸二氢钾对脐橙渣发酵饲料的蛋白含量的影响，脐橙渣发酵饲料真蛋白含量达到7.21%，与发酵前样品对比提高了13.72%。本次试验确定脐橙渣发酵饲料优化后配方的主要成分为：54%脐橙渣，6%麸皮，2%尿素，1%碳酸钙，0.1%磷酸二氢钾，0.1%安琪酵母，0.1%乳酸菌，0.01%纤维素酶，36.69%水。