采用科学方法 准确检测牛的肌肉和肝脏中双氯芬酸残留

王方雨 李宁 曹帅 赵雅丽

双氯芬酸钠（diclofenac sodium，CAS 15307- 79-6）作为苯乙酸类衍生物，是非甾体的解热镇痛抗炎药，起效较快。在我国，双氯芬酸钠已被批准用于猪、牛，辅助用于外伤手术、炎症等引起的疼痛和发热以及奶牛乳房炎的辅助治疗等，其在牛的肌肉、肝脏中残留限量（MRLs）均为5μg/kg，MRLs与欧盟规定相同。

本文以13C-双氯芬酸为内标，以5%氨水乙腈溶液为提取溶剂，以MAX固相萃取柱进行净化，以含有内标的DCF混合标准溶液进行定量，参照兽药残留检测要求，建立了肌肉、肝脏中双氯芬酸钠残留的检测方法，可用于牛可食性组织中双氯芬酸钠残留量的测定。

一、试验材料

1.仪器与设备。液相色谱-串联质谱联用仪，美国Agilent公司；BSA224S-CW型分析天平，感量0.0001g，sartorius；BSA423S电子分析天平，感量0.001g，sartorius；Mixer-400型组织匀浆机，瑞士步琦公司；DK-80型数显恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；MX-S涡旋混合器，SCILOGEX，美国；SORVALL Lynx 4000大容量低温离心机，Thermo Scientific，美国；SPE-24A固相萃取装置，北京科百特科技有限公司；DC300氮气吹干仪，杭州瑞诚仪器有限公司。

2.试剂与材料。乙腈、甲醛，质谱纯；乙腈，分析纯；甲酸，分析纯；乙酸铵，色谱纯；氨水，优级纯；Oasis？MAX固相萃取柱，3cc（60mg），美国Waters公司。

3 .对照品。双氯芬酸钠，中国食品药品检定研究院，批号100334-201803，含量按C14H10Cl2NNaO2计100%。双氯芬酸-（乙酰苯环-13C）钠盐（同位素标记物）， C A S：1 2 6 1 3 9 3-7 3-0，分子式13C6C8H10Cl2NO2Na·4.5H2O，分子量为405.16，Sigma-Aldrich公司，批号BCBT5244，含量100.0%。

4.试液配制。（1）双氯芬酸标准溶液。称取适量的双氯芬酸钠对照品，以甲醇溶解并定容，配制成质量浓度为1mg/mL的双氯芬酸标准储备溶液；以甲醇稀释成浓度为10μg/mL的双氯芬酸标准中间储备溶液，以及适当浓度的系列标准工作溶液。（2）同位素标记物的标准溶液。称取13C-双氯芬酸对照品，以甲醇溶解并定容，配制成浓度为0.2mg/mL的13C-DCF标准储备溶液；以甲醇稀释成浓度为10μg/mL的13C-DCF标准中间储备溶液，以及浓度为1μg/mL的13C-DCF标准工作溶液。（3）定量用系列混合标准溶液。分别准确吸取一定量的DCF和13C-DCF的标准工作溶液于同一容量瓶中，以甲醇稀释并定容，配制成13C-DCF浓度为20ng/mL，DCF浓度分别为2ng/mL（LOQ）、10ng/mL（1/2MRL）、20ng/mL（MRL）、40ng/mL（2MRL）的定量用系列混合标准工作溶液。

二、试验方法

1.检测条件。色谱柱为Agilent Eclipse plus C18，3.0mm×50mm，1.8μm；流动相为乙腈-水-甲酸，梯度洗脱；流速0.4mL/min，柱温35℃，进样量为10μL。电喷雾离子源（ESI），正离子模式，毛细管电压+4000V，喷雾器压力35psi，干燥气温度350℃，干燥气流量（氮气）10L/min。母离子、子离子、碎裂电压、碰撞能量等参数需要优化。

2.试料制备与保存。取适量新鲜的空白肌肉和肝脏，切割成小块后均质，作为空白试料。取均质后的空白组织，添加适宜浓度的标准工作溶液，作为空白添加试料。均在-20℃以下贮存备用。

3.样品前处理。（1）提取。取供试试料（2.0±0.02）g于15mL离心管中，加入10μL浓度为1μg/mL的13C-双氯芬酸标准工作溶液（内标的添加量与MRL基本一致），涡旋混匀后，加入5%氨水乙腈溶液5mL，涡旋混匀3min，3500g离心10min。移取上清液至另一离心管中。以玻璃棒将沉淀捣碎，加入5%氨水乙腈溶液5mL重复提取一次，合并提取液，待净化。（2）净化。MAX小柱依次以3mL乙腈、3.0mL水活化；将提取液全部过柱，依次用5%氨水乙腈溶液3mL、水3mL淋洗；用2%甲酸乙腈溶液5mL洗脱，收集全部洗脱液，于50℃条件下浓缩至干；加入0.1%的甲酸甲醇溶液0.5mL以完全溶解残渣，过0.22μm有机系微孔滤膜后，滤液供LC-MS/MS检测。

4.测定。（1）定性测定。在仪器最佳工作条件下，被测组分选择1个母离子和2个特征子离子，在相同试验条件下，样品中待测物质的保留时间与标准工作溶液中对应的保留时间偏差在±2.5%之内，将样品谱图中各组分定性离子的相对离子丰度与浓度接近的标准工作溶液中对应的定性离子的相对离子丰度进行比较，若偏差不超过表1规定的范围，则可判断样品中存在对应的待测物。

（2）定量测定。在仪器最佳工作条件下，取试样溶液和相应浓度的含有内标的混合标准溶液作单点或多点校准，按内标法以峰面积比计算。

5.检测限（LOD）与定量限（LOQ）测定。取系列浓度的DCF标准工作液，及13C-DCF标准工作液添加于空白试料中，制得不同浓度的空白添加试料，每个浓度制备6个平行样，按上述的样品前处理方法处理样品，做LC-MS/MS测定，共重复3次。采用峰高对峰高的方法，计算信噪比（SNR），取SNR≥3时的浓度为检测限。结合准确性和精密度试验，取信噪比SNR≥5时的浓度为定量限。

6.回收率与精密度测定。准确称取空白试料各2.0g，分别添加浓度为0.1μg/mL、0.5μg/mL、1.0μg/mL和2.0μg/mL的DCF系列标准工作溶液各10μL，以及浓度为1μg/mL的13C-DCF标准工作溶液10μL，混匀，制得13C-DCF添加浓度均为5 ng/g，DCF添加浓度分别为0.5ng/g（LOQ）、2.5ng/g（1/2MRL）、5.0ng/g（MRL）和10.0ng/g（2MRL）的空白添加试料，每个浓度制备6个平行样，共重复3次。将制得的样品按照上述前处理方法处理后，作HPLC-MS/MS测定；同时配制定量用系列混合標准溶液，与待测样品同时检测，采用单点校正进行定量计算，评估方法的回收率，以及日内和日间精密度。

三、结果

1.质谱和色谱条件优化。参照杨亚军等的方法，在ESI+模式下确定DCF及内标的母离子、子离子等，优化后的MRM参数见表2，优化后的梯度洗脱程序见表3。

2.色谱行为。肌肉、肝脏组织的色谱图分别见图1和图2。结果显示，空白基质在相应位置处没有干扰。

4.回收率及精密度。不同空白组织及牛奶中，DCF的加样回收率及精密度试验结果见表6、表7。不同组织中DCF的平均加样回收率均在70%-120%之间，日内和日间精密度均在15%以内，符合兽药残留的检测要求。

四、讨论

我国在对动物源性食品中兽药残留进行分析时，规定了方法的检测限与最高残留限量（MRL）相应值的数值关系，最高残留限量≤50μg/kg时，定量限可低于或等于最高残留限量。本研究建立的双氯芬酸钠残留量的HPLC-ESI+-MS/MS检测方法，在肌肉、肝脏中LOD为0.3μg/kg，LOQ为0.5μg/kg。LOQ能达到欧盟所规定的残留限量要求，回收率、变异系数等指标也符合动物源性食品中兽药残留检测的方法学要求。本方法稳定可靠、简便易行，可用于牛可食性组织中双氯芬酸钠残留量的测定，以及双氯芬酸钠注射液给药后牛可食性组织中双氯芬酸钠的残留消除研究。

感谢国家重点研究计划：养殖业产品质量安全保障技术应用示范（2019YFC1605700）的大力支持。

通讯作者：王方雨（1978.11-），男，副研究员，河南南阳，主要研究方向：生物技术。