草鱼鱼鳞柠檬法脱灰工艺的优化

李秋雨，刘红梅，李 彦，罗 灿，刘 焱

（1.湖南农业大学食品科学技术学院，湖南长沙 410128；2.湖南省发酵食品工程技术中心，湖南长沙 410128；3.芷江侗族自治县农业农村局，湖南芷江 419100；4.长沙理工大学化学与食品工程学院，湖南 长沙 410128）

0 引言

在传统的生产加工过程中，胶原蛋白的来源物质主要以陆生动物的皮或者骨为主，但由于宗教信仰和动物性流行病（疯牛病等） 的影响，胶原蛋白的原料来源在一定程度上受到了限制[1-3]。有研究表明，鱼鳞主要是由蛋白质、灰分构成，而蛋白质主要为胶原蛋白。因此，从鱼鳞中回收利用胶原蛋白，可以弥补常规来源胶原蛋白的不足，增加淡水鱼的附加值。鱼鳞中灰分的主要成分为羟基磷灰石、磷酸钙、磷酸镁等物质，其中羟基磷灰石含量最高，是灰分中的主要成分，其与胶原蛋白互相黏附，紧密结合，这种结构会使胶原蛋白的提取难度增大[4-6]。因此，在提取胶原蛋白前必须将鱼鳞的灰分除去。目前，灰分的去除方法主要有盐酸法、柠檬酸法及EDTA 法[7-12]。但EDTA 价格昂贵，无法实现工业化脱灰，而盐酸价格虽然便宜，却会破坏鱼鳞中的蛋白质[13]。因此，选择柠檬酸作为脱灰剂，以新鲜的草鱼鱼鳞为试验对象，通过单因素试验和正交试验，对草鱼鱼鳞脱灰工艺的最佳条件进行研究，为后续进一步研究鱼鳞胶原蛋白作基础[14-17]。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

新鲜草鱼鱼鳞，收集于长沙马王堆水产品市场；柠檬酸、硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸、硼酸、95%乙醇、无水乙醚、石油醚、盐酸、三乙醇胺、钙指示剂、乙二胺四乙酸二钠等，均为分析纯，国药集团化学试剂公司提供。

1.1.2 主要仪器设备

SX-4-10 型马弗炉，天津市泰斯特仪器有限公司产品；KDN-103F 型全自动凯氏定氮仪，上海纤检仪器有限公司产品；SXT-02 型索氏抽提器，上海洪纪仪器设备有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样品预处理

筛选出新鲜完整、无破损的草鱼鱼鳞，用蒸馏水多次清洗，直至将鱼鳞表面的细砂、土砾等杂质去除干净，将鱼鳞表面的水分自然晾干，备用。

1.2.2 单因素试验设计

（1） 不同柠檬酸质量分数对脱灰的影响。将预处理后的鱼鳞样品在4 ℃条件下，料液比为1∶16，柠檬酸质量分数梯度设置为2%，4%，6%，8%，10%，12%，浸泡6 h 对鱼鳞中灰分的脱除率进行测定，探究不同柠檬酸质量分数对鱼鳞脱灰效果的影响。

（2） 不同料液比对脱灰的影响。将预处理后的鱼鳞样品在4 ℃条件下，柠檬酸质量分数为10%，料液比设置为1∶10，1∶12，1∶14，1∶16，1∶18，1∶20，浸泡6 h，将鱼鳞表面用蒸馏水清洗干净，对鱼鳞中灰分的脱除率进行测定，探究不同料液比对鱼鳞脱灰效果的影响。

（3） 不同浸泡时间对脱灰的影响。将预处理后的鱼鳞样品在4 ℃条件下，料液比为1∶16，柠檬酸质量分数为10%，浸泡时间设置为2，4，6，8，10，12 h，将鱼鳞表面用蒸馏水清洗干净，对鱼鳞中灰分的脱除率进行测定，探究不同浸泡时间对鱼鳞脱灰效果的影响。

1.2.3 正交试验设计

为探究柠檬酸质量分数、料液比、浸泡时间这3 个因素对鱼鳞脱灰效果的影响，设计鱼鳞脱灰工艺L9（34）的正交试验表。

1.2.4 草鱼鱼鳞基本成分的测定

（1） 水分含量的测定。参照GB 5009.3—2016 中的第一法进行[18]。

（2） 灰分的测定。参照GB 5009.4—2016 中的第一法进行[19]。

（3） 脂肪含量的测定。参照GB 5009.6—2016 中的索氏抽提法进行[20]。

（4） 蛋白质含量的测定。参照GB 5009.5—2016中的凯氏定氮法进行[21]。

1.2.5 鱼鳞中灰分脱除率的测定

草鱼鱼鳞中灰分脱除率的大小可以作为灰分脱除效果的判断依据，灰分脱除率的计算公式如下：

式中：m1——新鲜草鱼鱼鳞中灰分的含量，mg；

m2——酸处理后样品中灰分的残留量，mg。

1.2.6 数据统计与分析

数据采用平均值±标准偏差的表示方式，并用DPS 2018 进行统计学分析，通过LSD 法进行组间显著性检验，显著水平为p＜0.05；利用Origin 2018 软件绘制试验结果图。

2 结果与分析

2.1 草鱼鱼鳞脱灰工艺单因素试验结果

2.1.1 柠檬酸质量分数对样品脱灰效果的影响

柠檬酸质量分数与样品灰分脱除率的关系见图1。

图1 柠檬酸质量分数与样品灰分脱除率的关系

从图1 可以看出，草鱼鱼鳞灰分的脱除率随着柠檬酸质量分数的升高呈现先迅速升高后缓慢降低的趋势，柠檬酸质量分数为6%时，灰分的脱除率最高，为96.86%；柠檬酸质量分数高于6%时，随着柠檬酸质量分数的逐渐升高，鱼鳞灰分的脱除率反而有所降低，这可能是因为当柠檬酸质量分数达到反应体系的最佳值时，再继续增大柠檬酸质量分数可能会使柠檬酸与钙结合，结合的物质附着在鱼鳞的表面，阻止鱼鳞中灰分的脱除，从而影响鱼鳞中灰分的脱除效果。由此可以确定，该因素的3 个水平为4%，6%，8%。

2.1.2 料液比对样品脱灰效果的影响

料液比与样品灰分脱除率的关系见图2。

从图2 可以看出，鱼鳞中灰分的脱除效果随着料液比的增加而增大，当料液比为1∶14 时，随着料液比的增大，灰分的脱除率从94.73%增加到99.63%；而当料液比大于1∶14 时，灰分的脱除率虽然在增加，但增加的幅度极小，几乎可以忽略不计。由此可以确定，该因素的3 个水平为1∶12，1∶14，1∶16。

图2 料液比与样品灰分脱除率的关系

2.1.3 浸泡时间对脱灰效果的影响

浸泡时间与样品灰分脱除率的关系见图3。

图3 浸泡时间与样品灰分脱除率的关系

从图3 可以看出，随着浸泡时间的增长，鱼鳞中灰分的脱除率呈现先大幅度增加后平稳增加的趋势。当浸泡时间少于6 h 时，灰分的脱除率从94.08%增加到97.86%，增加了3.78%；当浸泡时间多于6 h 时，鱼鳞中灰分的脱除率从97.86%增加到98.09%，增加了0.23%，增加的幅度较小。由此可以确定，该因素的3 个水平为4，6，8 h。

2.2 草鱼鱼鳞脱灰工艺正交试验结果

根据单因素试验的结果，确定柠檬酸质量分数、料液比、脱灰时间这3 个因素的3 个水平，为了明确各因素对脱灰效果影响的显著性，采用LSD 法对正交试验的结果做方差分析。

样品脱灰工艺正交试验因素与水平设计见表1，鱼鳞脱灰工艺L9（34）正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表1 样品脱灰工艺正交试验因素与水平设计

从表2 可以看出，草鱼鱼鳞中灰分的脱除率最高为99.63%，此时因素的组合为A1B2C2，影响鱼鳞中灰分脱除效果的主次关系为因素B＞因素C＞因素A。从表3 可以看出，因素B 及因素C 对脱灰效果的影响显著（p＜0.05），因素A 对脱灰效果的影响不显著（p＞0.05）。分析试验结果可知，草鱼鱼鳞中灰分的脱除效果最佳的组合为A1B2C2，这与正交试验结果一致。因此，鱼鳞脱灰的最佳工艺条件为A1B2C2，即以1∶14 的料液比和质量分数为4%的柠檬酸溶液处理鱼鳞6 h 可使鱼鳞中99.63%的灰分被脱去。

表2 鱼鳞脱灰工艺L9（34）正交试验结果

表3 方差分析结果

2.3 草鱼鱼鳞脱灰前后基本成分的变化

鱼鳞脱灰前后基本成分的含量见表4。

表4 鱼鳞脱灰前后基本成分的含量/%

从表4 可以看出，新鲜草鱼鳞样品中水分含量为12.66%，灰分含量为21.35%，总蛋白含量为56.6%，脂肪含量为0.235%，经过脱灰处理后鱼鳞样品中水分含量为14.43%，总灰分含量为0.44%，总蛋白含量为83.04%，脂肪含量为0.076%。结果表明，未经脱灰处理的鱼鳞中灰分含量较高，会阻碍胶原蛋白的提取，而经脱灰处理后鱼鳞中的灰分含量低于2%，符合企业对灰分的要求。在脱灰的过程中脂肪含量降低到0.076%，这可能是因为鱼鳞中部分脂肪随着柠檬酸溶液而流失。

3 结论

通过柠檬酸法研究草鱼鱼鳞脱灰的最优工艺条件，结果显示脱灰的最佳工艺条件为柠檬酸的质量分数4%，料液比1∶14，浸泡时间6 h。在该工艺条件下，鱼鳞中99.63%的灰分被脱去，鱼鳞中剩余的灰分为0.37%，灰分含量符合企业生产加工的要求（低于2%）。有研究表明，鱼鳞中脂肪与胶原蛋白紧密结合，其不利于胶原蛋白的提取。因此，为获得目的胶原蛋白，在此之前还要对鱼鳞样品进行脱脂处理。但鱼鳞样品经过脱灰处理后，鱼鳞中脂肪的含量从0.235%降低至0.076%，脂肪含量几乎可以忽略不计。因此，经该工艺处理的鱼鳞，不仅可以最大程度地脱除灰分，还可以为后续的试验节省脱脂这一预处理的时间。