人肺癌H1299阿霉素耐药性细胞株的建立及鉴定*

陈 慧，陈玉梅，胡招娣，杨 潮

(赣南师范大学 生命科学学院，江西 赣州 341000)

癌症是威胁人类身体健康最严重的疾病之一，对癌症的预防和有效治疗已成为当今世界最具有挑战性的课题.在诸多癌症类型中，肺癌是一类最为常见的恶性肿瘤，其病理类型包括小细胞肺癌和非小细胞肺癌[1].世界卫生组织公布的数据显示，在2018 年肺癌是全球发病率和致死率最高的恶性肿瘤，约有 210 万肺癌新发病例，而因肺癌死亡的患者人数高达176 万人[2].在我国，肺癌的发病率和死亡率也同样位居所有癌症的首位，2015年我国肺癌新发病例高达78.7万人，死亡人数则达到63.1万人[3].目前，早期肺癌可通过手术成功切除，中晚期肺癌则需要放化疗治疗[4].但随着化疗次数增多，耐药率越来越高，目前晚期肺癌尚无理想治疗的方法.因此，深入研究肺癌的耐药机制，对肺癌的化学预防和治疗具有重要意义.

阿霉素(Doxorubicin，Dox)是一种广谱性的抗肿瘤抗生素，通过抑制细胞中RNA 和DNA的合成，实现对癌细胞的杀伤.但在治疗过程中，长期使用Dox常会导致癌细胞发生耐药性.为了深入研究肺癌获得性Dox耐药的分子机制，构建稳定的耐药细胞模型是开展这方面研究的基础.本研究采用浓度梯度递增的诱导方式建立人肺癌细胞H1299 Dox耐药细胞株H1299 R，并对其耐药性进行初步鉴定，包括比较耐药细胞株H1299 R和野生型细胞H1299 W形态特征、增殖曲线；Real-time PCR检测耐药细胞株H1299 R和野生型细胞H1299 W与癌细胞产生耐药性、发生转移和侵袭相关的基因表达量.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

人肺癌H1299细胞株由中国科学院干细胞库提供.

1.1.2 试剂

RPMI-1640培养基和胎牛血清(Gibco 公司)；10×PBS和胰酶TEMED(碧云天生物技术公司)；阿霉素(Doxorubicin)、二甲亚基砜(DMSO)和引物合成(上海生工生物工程有限公司)；逆转录试剂盒(Takara公司)；Trizol 和2×SYBR Green Mix(百泰克生物公司).

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

人肺癌H1299细胞株选用含10% FBS和1%抗生素的1 640培养基，置于37 ℃和5%CO2的细胞培养箱中培养.

1.2.2 耐药细胞株的建立

采用浓度梯度递增法处理人肺癌H1299细胞，使用的阿霉素浓度依次为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL，连续培养6个月，获得耐药细胞株H1299 R.具体步骤如下:阿霉素的使用浓度从0.1 μg/mL开始，加药24 h后换液，细胞稳定3～5 d后再进行传代.待细胞呈对数生长时再次添加与之前相同浓度的药物处理，照该步骤重复3遍后再开始增加药物浓度，每传2～3代逐步提高阿霉素浓度，提高的浓度梯度以每次提高浓度后72 h存活细胞比例达80%以上，最终筛出耐药细胞株H1299 R.

1.2.3 MTT实验

取对数生长期H1299 W和H1299 R细胞，以3 000个/孔(耐药增殖实验则以5 000个/孔)的量接种于96孔板(同时设置3-5个复孔，)，分别培养1、2、3和4 d后进行OD值检测.耐药增殖实验则在细胞接种时，在培养液中直接添加终浓度为5 μg/mL阿霉素.检测时每孔加入20 μL 5mg/mL的MTT 溶液，与细胞培养4 h后去除旧培养液，PBS清洗1次，每孔加入200 μL DMSO，避光置于水平摇床上震荡10 min.在490 nm处检测吸光度(A)值，记录数据后绘制H1299 W和H1299 R的生长曲线.

1.2.4 荧光定量PCR实验

提取未处理的肺癌细胞H1299 W和耐药细胞H1299 R的总RNA，使用逆转录试剂盒进行反转录实验获得相应样本的cDNA.以cDNA为模版，进行荧光定量PCR实验，检测H1299 W和H1299 R细胞中β-actin、MDR1、MMP-2、MMP-9、ABCG2、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin等基因的mRNA表达水平.所采用引物序列如表1：

表1 荧光定量PCR引物序列

1.2.5 数据统计分析

实验数据通过Excel 2003软件进行分析，采用T-Test参数比较不同组别的差异性，其中0.001≤P≤0.01具有高度统计学意义，标注为**，P≤0.001具有显著性差异，标注为***.

2 结果与分析

2.1 Dox处理人肺癌H1299细胞形态的变化

倒置荧光显微镜下观察人肺癌H1299 W和H1299 R细胞的形态时，发现H1299 R细胞形态较H1299野生型细胞的形态发生了较大变化，细胞大小、形态均发生变化，细胞更细长，细胞内尤其是近胞膜处有较多深色物质聚集(图1).

图1 H1299 W 和H1299 R细胞形态

2.2 细胞增殖曲线测定

耐药性细胞株H1299 R和野生型细胞H1299在相同条件下培养4 d.MTT法检测耐药性细胞株H1299 R和H1299野生型细胞,增殖未产生一定的差异(见图2).

图2 H1299 W 和H1299 R细胞增殖曲线

2.3 Dox对H1299 W和H1299 R细胞毒性的检测

耐药性细胞株H1299 R和H1299野生型细胞在Dox药物的处理下培养4 d，MTT法检测细胞增殖情况。由图3可看出，用5 ug/ml Dox处理细胞后，耐药性细胞株H1299 R细胞增殖曲线仍呈现上升趋势，但是增长缓慢；而H1299野生型细胞的细胞数呈现上升趋势.

图3 DOX处理H1299 W 和H1299 R的细胞增殖曲线

2.4 H1299 W和H1299 R的细胞中耐药基因和转移性基因表达差异

为了考察耐药细胞株H1299 R的基因变化情况，收集耐药性细胞株H1299 R和H1299野生型细胞的RNA样本，经反转录后进行Real-time PCR检测.实验结果发现耐药性细胞株H1299 R中与癌症耐药、转移和上皮间质转化相关基因如MDR1、MMP-2、MMP-9、ABCG2、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin的mRNA表达水平均高于H1299野生型细胞组，呈显著性差异且具有统计学意义(见图4).

图4 肿瘤耐药性相关基因在H1299 W和H1299 R中的mRNA表达水平

3 讨论

阿霉素(Adriamycin)是一种蒽环类抗菌化学药物，对细胞增长具有抑制作用，其在结构上与柔红霉素相类似[5]，在各种恶性肿瘤临床治疗中具有重要的作用.它作为一种新型抗肿瘤药物，在实体瘤(乳腺癌、恶性肉瘤、支气管癌和神经母细胞瘤)以及血液学恶性肿瘤(恶性淋巴瘤和急性白血病)中抑制细胞的增殖[6].阿霉素抑制肿瘤细胞的增殖的作用机制是，其本身可插入DNA双链结构中，使双链DNA的结构发生改变，另外，其可抑制拓扑异构酶Ⅱ的功能，导致DNA的结构损伤，使得肿瘤细胞凋亡[7].阿霉素虽有作用机制清晰、费用便宜等优点，但在临床应用中仍被发现会导致癌症患者的耐药性产生，影响治疗效果.

多药耐药是目前肿瘤细胞免受化疗药物攻击的最重要的细胞防御机制[8].MDR1基因的过表达是肿瘤产生多药耐药的主要机制之一[9].MDR1可通过水解ATP获取能量，将细胞中的化学药物排出癌细胞外，以减少癌细胞内的化学药物浓度，从而使细胞产生耐药性[10].有研究证实，通过RNA干扰技术沉默 MDR1 基因表达，可提高多种肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，如肺癌、乳腺癌等[10-11].除此之外，在一些新辅助治疗和手术后辅助治疗中使用一些紫杉类药物，使肿瘤患者在疾病复发转移时往往会对这类药物产生耐药[12-13].已有研究评估治疗非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌(SCLC)的肿瘤药物氨柔比星(amrubicin)的活性，发现该药物难以治愈复发性的小细胞肺癌[14].近年来，筛选耐药细胞株已成为研究者研究工作的重要研究工具，研究者们运用耐药细胞株来揭示肿瘤细胞的耐药机制，为治疗肿瘤提供更有效的方法.因此，建立癌细胞的耐药细胞株在科研工作中具有重要意义.

本实验首先建立了人肺癌阿霉素耐药性细胞株H1299 R，在荧光倒置显微镜下观察到H1299 R细胞形态较野生型细胞H1299 W的形态发生了较大变化，细胞大小、形态均发生变化，细胞更细长，细胞内尤其是近胞膜处有较多深色物质聚集.MTT法检测出在正常情况下培养耐药性细胞株H1299 R和H1299野生型细胞增殖未产生一定的差异，而Dox对H1299 W 和H1299 R细胞毒性存在显著性差异.Real-time PCR研究结果也发现耐药性细胞株H1299 R中与癌细胞耐药性、转移和侵袭相关基因MDR1、MMP-2、MMP-9、ABCG2、E-Cadherin、N-Cadherin和Vimentin基因mRNA的表达量均高于野生型细胞H1299 W组.这些结果预示着细胞耐药性增强可能是这些基因表达增加，也可能存在多种基因共同通过不同的信号通路对癌细胞所用化疗药物产生耐药性.本研究建立人肺癌细胞H1299 Dox耐药细胞株H1299 R，并对其耐药性进行初步鉴定，为深入研究肺癌获得Dox耐药的分子机制奠定了基础.