缺氧诱导因子-1α在牦牛肺脏中的表达及分布情况

赵晓萌，买雨晨，乔自林,2,3 ，杨 琨,2*

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730100;2.西北民族大学 生物医学研究中心 甘肃省动物细胞技术创新中心，甘肃 兰州 730030;3.西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室，甘肃 兰州 730030）

牦牛是我国以青藏高原为起源的高原特种动物，能在海拔3 000～4 000 m左右、氧分压在11 600～14 500 Pa的高寒气候中正常生存，其生长发育、新陈代谢等各方面的生理机能与当地的环境形成了良好的适应机制，是研究高原生物低氧适应性的良好材料。

异源二聚体缺氧诱导因子-1(hypoxia inducible factor-1, HIF-1）由氧不稳定的α亚基和氧稳定的β亚基组成[1]，是维持体内氧环境稳定、调节氧需求与供应的重要因子。缺氧诱导因子-1α作为能决定缺氧诱导因子-1活性的唯一氧调节亚单位[2]，要想发挥其功能必须要保持其稳定性, HIF-1α蛋白的稳定性是由氧依赖性和非氧机制调节的[3]。在正常氧气浓度下，HIF-1α经泛素化迅速降解[4]后表达很少。在低温缺氧条件下，HIF-1α与HIF-1β形成二聚体入核后结合HRE，使缺氧表达下显著增高[5]。此外，HIF-1α还能够介导能量代谢、细胞的生长和凋亡、血管新生、氧的摄取和运输等表达，参与细胞内氧平衡状态的调节[6]。

本研究以牦牛肺脏作为实验样本，应用石蜡切片、HE染色和免疫组化的方法来探索HIF-1α在牦牛肺部的表达及分布情况以及HIF-1α对高原动物低温缺氧的作用，具有高度的创新性和研究价值，旨在进一步为HIF-1α对高原动物低氧性的机制提供理论依。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 甘肃省临夏回族自治州某屠宰场采集牦牛健康肺脏。经宰割后迅速将牦牛肺脏样本放于4%的多聚甲醛中固定。

1.1.2 试剂与仪器 0.01mol/LPBS磷酸盐缓冲液，0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液，兔多克隆抗体HIF-1α（bs-1313R）、免疫组化试剂盒（SP-0023），DAB显色试剂盒（DA1015-3)，均购于北京博奥森生物技术有限公司，病理组织切片机、显微镜照相系统等。

1.2 HE染色及免疫组化SP染色

1.2.1 苏木精-伊红染色 牦牛肺脏样本经梯度乙醇脱水、常规石蜡包埋后，切成石蜡切片（厚4 μm），随后进行脱蜡，染色，脱水透明，封片，其具体的HE染色方法按说明书来进行。

1.2.2 免疫组化SP染色 HIF-1α兔多克隆抗体浓度稀释1:100，按抗体说明书4℃冰箱冻藏，用前及时解冻。石蜡切片脱蜡复水后，用PBS浸泡5 min后进行经抗原修复、阻断剂阻断、封闭液封闭，滴加一抗孵育，阴性对照组不加入兔多克隆抗体HIF-1α。滴加DAB显色液（现用现配）。光镜下观察显色，适宜可终止反应。自来水冲洗10 min后按HE染色步骤进行苏木精复染至封片镜检。

1.3 图像采集及结果判定

将染色完成的切片放置于显微镜照相系统下采集信息图像。免疫组织化学染色后在显微镜下根据着色程度可呈现出强阳性、中性阳性、弱阳性和阴性表达四种结果。若HIF-1α在胞浆、胞核呈现深棕黄色或黄褐色则为强阳性表达、棕黄色较浅是弱阳性表达、处于二者之间是中性阳性表达、未出现棕黄色或与背景色相似的是阴性表达。

2 结果与分析

2.1 牦牛肺脏的组织学结构

牦牛肺脏内支气管分支、大量肺泡及肺泡间隔组织。终末细支气管环行平滑肌较为明显且完整，肺泡多为半球型小囊，或围成肺泡管、肺泡囊，可见肺泡上皮细胞。由I型上皮细胞包覆的肺泡壁较薄（见图1）。

图1 牦牛肺脏组织切片HE染色结果

2.2 免疫组织化学中的表达

HIF-1α在牦牛肺脏组织呈广泛性表达。依据免疫组化结果展示HIF-1α在细胞表达阳性颜色的深浅可知，肺泡、终末细支气管环形平滑肌呈现棕黄色，为强阳性表达。肺泡隔间充质细胞质呈中性表达且少量表达。细胞核内呈阴性表达（见图2）。

图2 牦牛肺脏HIF-1α蛋白免组织化学检测结果

3 讨论

肺脏是机体在高原环境下最先进行代偿的器官，也是动物机体与外界进行气体交换的场所。长期生活在低氧环境的牦牛的肺气-血屏障较薄，能在气体交换过程中更有利于单位时间内的氧气交换量[7]。对于肺脏不同结构HIF-1α表达的功能也不同。在肺脏中毛细血管对HIF-1α存在依赖，且肺泡-毛细血管屏障功能对肺脏起着重要调控作用，当其功能发生紊乱时会导致严重的肺水肿、肺损伤等情况[8]；在肺泡肺气管发育中能调控血管网络的形成，当肺血管发育不足时会造成肺泡的形成不良[9]；在生长因子的内皮细胞中HIF-1a能调控其表达，通过增强血管的通透性促进肺动脉平滑肌细胞增殖[10、11]，以此来诱导血管生成因子的生成与表达，维持血管的平衡。

HIF-1α作为低氧调控的关键介质，在常氧下几乎不发生表达，在缺氧时呈高度表达。HIF-1α不仅能促进细胞的增殖分化，还能介导炎症的形成产生。在低温缺氧条件下，HIF-1α能够激活血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)等来促进肺血管的重构，从而使组织细胞保持耐受低氧稳定状态[12]，参与细胞代谢、血管收缩、炎症、氧的摄取等多种生理病理过程,在各种细胞组织中发挥作用。但也会通过激活不同的炎症因子引起肺急性肺损伤、肺癌、慢性阻塞性肺炎等病症。当肺小动脉肌化作用加强, 诱导基质细胞和肺动脉外膜成纤维细胞增殖造成肺血管重构时,则会引发肺动脉高压[13]。但也有研究表明HIF-1α的部分缺失会使肺动脉高压症状减轻，以此说明对HIF-1α慢性缺氧引起的病理变化具有保护作用[14]。

有学者已经得出HIF-1α在牦牛的心脏中表达程度最高，其次是肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等组织[15]的结论，证明HIF-1α在肝脏存在表达。本研究则得出HIF-1α在牦牛肺脏中的肺泡管、终末细支气管环形平滑肌中呈现高度表达的情况，HIF-1α大量分布于肺的导气部，表明低温缺氧能刺激HIF-1α在肺导气部的表达，从而对牦牛的生长发育产生影响。

4 结语

本研究显示缺氧诱导因子-1α在牦牛肺脏中的肺泡管、终末细支气管环形平滑肌中呈强阳性，肺泡隔间充质细胞质呈中性表达且少量表达，在细胞核内呈阴性表达。以此得出低温缺氧的条件下牦牛肺脏能够表达缺氧诱导因子-1α的特性，进而推测缺氧诱导因子-1α对高原动物低温缺氧适应性起着重要调节作用。