PM 2.5对大鼠肺组织Nrf2/HO-1通路的影响及维生素C的干预作用

韩书芝 李海月 尹航 平芬

1河北省人民医院老年病三科,石家庄050051;2承德医学院附属医院呼吸科067000

随着社会工业化的发展,空气污染问题已成为公众关注的焦点。近年来,频发的雾霾天气已成为我国空气污染的主要原因。而雾霾中的细颗粒物(PM2.5)已成为危害人类健康最严重的且危害正在进一步加深的空气污染因素之一[1]。流行病学研究表明,大气细颗粒物与多种呼吸系统疾病及心脑血管疾病的发病率与死亡率密切相关[2]。PM2.5对健康的不利影响首先表现在呼吸系统,PM2.5长期吸入可以导致气道上皮纤毛粘连、紊乱、倒伏和缺失;影响杯状细胞和浆液细胞的分泌功能[3];降低自然杀伤细胞和肺泡巨噬细胞的数量和活性,降低气道的防御功能[4]。不仅如此,PM2.5进入肺泡后,肺泡表面活性物质吸附在PM2.5表面,使得肺泡表面活性物质结构发生改变,破坏了其正常物理性质,增加哮喘加重及呼吸道感染、肺结核、肺癌等呼吸系统疾病的发病率[5]。因此,研究PM2.5肺损伤机制,为临床提供有效的防御措施具有重要的临床意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康雄性Wistar大鼠40只,体质量150～200 g,均购自河北医科大学实验动物中心,饲养于河北省人民医院动物饲养室。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组 健康雄性Wistar大鼠40只,在动物饲养室内适应性喂养一周,自由进食、饮水,饲养温度为22～24 ℃,湿度为45%～55%,昼夜节律为12 h。采用随机数字表法随机分为5组。(1)空白对照组 (C 组,n=8):不予处理。(2)生理盐水对照组 (NS组,n=8):给予气管插管滴生理盐水1 ml/kg,每周1次,共4次。(3)PM2.5染毒组 (PM2.5组,n=8):给予气管插管滴PM2.5(提前用生理盐水配成7.5 g/L)1 ml/kg,每周1次,共4次。(4)维生素C 低剂量组(LVC组,n=8):染毒同PM2.5组,实验开始后给予10 ml/kg维生素C (提前用蒸馏水配成10 g/L)灌胃,每天1次,共4周。(5)维生素C高剂量组(HVC组,n=8):染毒同PM2.5组,实验开始后给予10 ml/kg维生素C (提前用蒸馏水配成30 g/L)灌胃,每天1次,共4周。5组动物均自由进食水,于最后一次染毒24 h后处死动物,取材检测。本研究符合《赫尔辛基宣言》的原则。

1.2.2 标本留取 用10%水合氯醛 (4 ml/kg)腹腔注射麻醉,抽取5 ml腹主动脉血后处死。取右下肺组织,甲醛固定,常规石蜡包埋,切片、HE染色,光镜下观察肺组织病变。余肺-80 ℃保存待测。

1.2.3 蛋白质印迹检测HO-1、Nrf2的表达 取少量肺组织称量,记录;按试剂盒要求加裂解液、PMSF和蛋白酶抑制剂于2 ml EP管中混匀。提取肺组织细胞蛋白并用BCA 法测蛋白浓度;取40μg蛋白上样,SDS-PAGE 电泳分离蛋白后转膜到PVDF膜上。将膜放入25 ml封闭液,室温摇2 h;一抗4 ℃孵育过夜;TBST 洗涤3次×10 min;二抗常温孵育1.5 h,TBST 洗涤3 次×10 min。将膜置于发光混合液 (A、B 试剂各0.1 ml),放入蛋白质印迹成像仪照相。用目的条带与β-actin的灰度值的比来表达目的蛋白的相对表达量。

1.2.4 实时PCR 检测HO-1 m RNA 的表达 提取RNA:取约100 mg肺组织于2 ml EP管中,加1 ml 的RNAiso Plus 匀 浆,室 温 静 置5 min;12 000×g,4 ℃,离心5 min,取上清放入另一1.5 ml EP管中。采用Trizol方法经分离、沉淀、洗脱和再溶解获取RNA。测RNA 浓度,并记录。电泳鉴定RNA。逆转录合成c DNA。采用实时PCR检查HO-1 m RNA 的表达。在荧光定量PCR运行过程中,借助软件实时观察PCR 荧光扩增曲线,采集分析数据。熔解曲线:Tm＞85 ℃,并呈单峰认为扩增为特异性;相对定量结果计算2-ΔΔCt:ΔCt=Ct目标基因-Ct内参基因,ΔΔCt=ΔCt实验样本-ΔCt对照样本。计算表达水平比值,比值=2-ΔΔCt。HO-1正向引物:5'-GCTCTATCGTGCTCGCATGA-3',反向引物:5'-AATTCCCACTGCCACGGTC-3';β-actin 正 向 引 物:5'-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3',反向引物:5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3'(由上海英潍捷基贸易有限公司提供)。

1.3 统计学分析 采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。计量资料以±s 表示,采用单因素方差分析比较各组间指标的差异,两组间比较采用LSD-t检验。P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理表现 光镜下可见,C组和NS组大鼠肺泡结构完整,间质无水肿,肺泡间毛细血管无扩张充血。PM2.5组大鼠肺泡间隔明显增厚或融合,肺泡间隔断裂,可见明显的间质水肿,毛细血管扩张,小气道及间质内大量炎性细胞浸润。维生素C 干预组大鼠肺泡破坏及炎性细胞浸润较PM2.5组大鼠减轻。见图1。

图1 各组大鼠肺组织病理表现 A:空白对照组;B:生理盐水对照组;C:PM 2.5染毒组;D:维生素C 低剂量组;E:维生素C高剂量组 HE ×100

2.2 各组大鼠肺组织中Nrf2、HO-1蛋白表达 与C组及NS组比较,PM2.5组Nrf 2(总蛋白及核蛋白)及HO-1 表达明显降低 (P 值均＜0.05);PM2.5组Nrf2 核 蛋 白 及HO-1 蛋 白 与LVC 组 及HVC组比较差异有统计学意义 (P 值均＜0.05);PM2.5组Nrf2总蛋白与HVC组比较差异有统计学意义(P ＜0.05),与LVC 组比较差异无统计学意义。各蛋白表达在维生素C 不同剂量组间差异无统计学意义。见图2。

图2 各组大鼠肺组织中HO-1蛋白、Nrf2总蛋白及核蛋白表达的比较 A:电泳图;B:柱状图

2.3 各组大鼠肺组织中HO-1 m RNA 表达 与C组 及NS 组 比 较,PM2.5组 大 鼠 肺 组 织HO-1 m RNA 表达下降 (P 值均＜0.05);维生素C 各剂量组HO-1 m RNA 表达较PM2.5组升高 (P 值均＜0.05),维生素C 低、高剂量组间差异无统计学意义。见图3。

3 讨论

目前在我国PM2.5污染状况十分严峻。大气PM2.5的主要来源为汽车尾气和煤炭燃烧。相比大气PM2.5,煤炭燃烧所产生的PM2.5中含有更多的有机物(如多环芳烃)及砷、镍等重金属成分,其组成复杂,有害元素高度富集。研究发现,相同剂量不同组分的PM2.5细胞毒性不同,其中水溶性成分的细胞毒性大于有机成分的细胞毒性[6]。

图3 各组大鼠肺组织中HO-1 m RNA 的表达

流行病学资料提示PM2.5与呼吸系统、循环系统、消化系统、神经系统、生殖系统及内分泌系统疾病的发生发展密切相关[7-9]。PM2.5通过呼吸道进入体内,首先对呼吸系统造成损害,导致呼吸系统疾病的发病率升高及肺功能的下降。一项针对北京市区门诊呼吸道疾病就诊的统计分析发现,PM2.5浓度每增加10μg/m3,总呼吸系统疾病的就诊数增加0.23%,其中上呼吸道感染增加0.19%,下呼吸道感染增加0.34%,COPD 急性加重增加1.46%[10]。环 境PM2.5浓 度 每 上 升2 μg/m3,FEV1下降13.5 ml,并且下降速度每年增加2.1 ml[11]。

目前认为PM2.5所致肺损伤的主要机制包括氧化应激、炎症损伤、免疫损伤,各个机制之间并不是完全独立存在的,氧化应激可导致炎性损伤,炎性损伤也可导致体内氧化/抗氧化平衡失调。细胞染毒实验发现,PM2.5吸附的重金属离子可通过促进NADPH 氧化酶形成大量自由基,进而使人肺上皮细胞遗传物质发生断裂、脂质过氧化,并可以参与调节一些与细胞活力相关的信号通路。机体细胞本身具有复杂的抗氧化系统,包括Akt/STAT3/NF-κB 系 统、Nfr2/HO-1 信 号 通 路[12-13]等。本文对Nrf2/HO-1抗氧化酶通路在PM2.5所致肺氧化损伤过程中的作用进行了观察。Nfr2/HO-1信号通路具有抗炎、抗氧化、减少线粒体损伤、调节Ca2+内流、调控细胞死亡等作用,是抗氧化应激反应不可或缺的信号通路。生理状态下,在胞质内的Nrf2 与细胞骨架相关性抑制蛋白Keap1结合形成一个复合体,使Nrf2经泛素蛋白酶途径降解。PM2.5可刺激机体产生氧化应激,引起Keap1的修饰,从而使Keap1募集Nrf2的功能发生改变,Keap1-Nrf2复合体解离,Nrf2从胞质转位到细胞核,与受其调控的抗氧化酶基因的ARE结合,从而启动编码解毒和抗氧化的基因表达,使其表达上调,促进细胞存活。HO-1即是受其调控的一个非常重要的酶类,形成一个Nrf2/HO-1通路[13]。

Nrf2诱导HO-1等Ⅱ相酶的合成在抗氧化应激中发挥重要作用,甚至可以预防突变和癌症。Nrf2虽然可被外界刺激物诱导,但有一定界限,当刺激的浓度和时间延长时,Nrf2的表达下降[14]。HO-1作为机体内保护性诱导蛋白可以通过抗氧化、抗炎、抗凋亡等发挥器官保护作用。其分解血红素产生的降解产物CO、Fe2+、胆绿素也具有抗氧化、自由基清除等极强的肺保护作用。

本实验中给予大鼠PM2.5气管滴药4次后,肺组织中Nrf2 总蛋白及核蛋白表达均明显下降,HO-1蛋白及m RNA 表达也减少,给予维生素C干预后大鼠肺组织中Nrf2及HO-1表达较PM2.5染毒组升高。通过蛋白质印迹、PCR 检测均证实了这一点。推测维生素C干预后可使PM2.5暴露大鼠肺组织Nrf2总蛋白表达上调,并促进Nrf2的活化转位入核促进其下游抗氧化酶HO-1及其降解产物胆红素(主要是间接胆红素)共同发挥抗氧化作用。不同剂量维生素C 干预组差异无统计学意义,提示低剂量维生素C 可发挥抗氧化作用。有研究提示高剂量维生素C可加重氧化损伤[15]。

以 上 结 果 表 明,PM2.5可 引 起Nrf2/HO-1 信号通路表达异常导致肺脏氧化损伤,维生素C 对PM2.5所引起的损伤有一定程度的改善,其确切机制有待进一步研究。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突