2017-2018年广州市乙型流感病毒血凝素和神经氨酸酶基因特征分析

夏炫梓 宋文俊 杨春光 曾志奇 杨子峰 王新华

广州医科大学附属第一医院 呼吸疾病国家重点实验室临床病毒室510182

流感病毒属于正黏病毒科的分段单股负链RNA 病毒,分为甲、乙、丙、丁4 个类型[1]。临床上常见的是甲型流感病毒和乙型流感病毒,甲型流感病毒在自然界中存在广泛的中间宿主,可在人和动物之间快速传播和交叉感染,乙型流感病毒具有较强的宿主特意性,一般只感染人类和海豹[2-4]。在每年的流感季节,甲型流感病毒和乙型流感病毒都会在人群中共同传播并引起不同严重程度的呼吸道疾病。季节性流感流行是由H3N2 和H1N1 亚型的甲型流感病毒以及包含2种谱系的乙型流感病毒引起的,其中乙型流感病毒每2～4年会成为主导季节性流行的主要毒株,且2个谱系的病毒会呈现共同传播和交替流行的特点[5]。某一地区的季节性流感暴发经常会对人类的健康和社会的经济产生重大的影响[1,6-7]。甲型流感病毒由于传播速度快,感染性强,抗原容易发生变异,所以经常引起局部的暴发,甚至是世界性的大流行。而乙型流感病毒虽不及甲型流感病毒的传播速度和范围,通常引起局部地区的流行,但也增加了流感疾病负担,特别是在儿童和老年人群体中引起严重的疾病后果[8-9]。乙型流感病毒根据抗原特性和血凝素基因特征的不同,可分为Yamagata和Victoria两大谱系,分别以B/Yamagata/16/88 和B/Victoria/2/87 为 代 表株[10]。本文通过对2017-2018年广州市内流行的乙型流感病毒基因特征进行研究,明确乙型流感病毒的变异和流行特点,并与WHO 推荐的病毒疫苗株进行比对分析匹配度,为流感监测防控提供科学数据。

1 材料与方法

1.1 毒株来源 本实验所采用的病毒株来源于2017年12月至2018年4月在广州市流感监测哨点医院采集的经胶体金筛查呈现流感阳性患者的咽拭子样本,通过免疫荧光法检测出的乙型流感病毒样本保存于广州呼吸疾病健康研究院进行后续实验。

1.2 病毒分离培养 将咽拭子标本充分振荡混匀,取400μl接种于对数生长的单层狗肾细胞中,置于35.5 ℃、5% CO2培养箱中培养,每日观察细胞病变情况。当70%～90%细胞出现聚集、脱落、融合等细胞病变形态时,收集病毒培养上清液,用鸡红细胞悬液进行血凝试验。将血凝滴度≥8的病毒上清液进行病毒核酸提取、PCR 扩增和病毒亚型鉴定,剩余上清液保存于-80 ℃冰箱。血凝滴度＜8的病毒上清液继续进行培养。

1.3 病毒RNA 提取 将成功分离扩增的乙型流感病毒采用德国QIAGEN 公司QIAamp Viral RNA Mini Kit试剂盒提取病毒RNA,具体步骤参考试剂盒说明书。

1.4 一步法RT-PCR 和产物纯化 一步法RTPCR 试剂盒Prime Script One Step RT-PCR Kit由日本TAKARA 公司生产。测序所用引物自行设计(表1),由生工生物工程 (上海)有限公司合成。反应体系:Prime Script one Step Enzyme Mix 2μl,2×one Step Buffer 25 μl,RNase Free d H2O 20μl,上下游引物 (10μmol/L)各1μl,模板RNA 1μl。反应条件:第一阶段50 ℃30 min,94 ℃2 min,1个循环;第二阶段94 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃115 s,35 个 循 环;第 三阶段72 ℃10 min,1 个循环。随后冷藏 (4～8 ℃)保存。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳切割回收后用德国QIAGEN 公司QIAquick Gel Extraction Kit试剂盒进行纯化,具体步骤参考试剂盒说明书。

1.5 序列测定和分析 PCR 纯化产物送至生工生物工程(上海)有限公司进行测序。测序结果采用Vector NTI软件进行核苷酸序列拼接,拼接结果采用Bioedit软件进行序列比对,分析HA 和NA蛋白的关键氨基酸位点和变异位点。WHO 推荐的2017-2018年度的三价疫苗组分中包含的Victoria系毒株为B/Brisbane/60/2008,四价疫苗组分中包含的Yamagata系毒株为B/Phuket/3073/2013[11]。使用MEGA 7.0软件中Clustal W 法做序列比对分析,Neighbor-joining法做遗传进化分析。HA 和NA 进化分析参考株选用欧洲疾病预防控制中心2017-2018 年流感季的概况报告 (http://ecdc.Europa.eu),Yamagata系1～3分支参考株是B/Florida/4/2006、B/Brisbane/3/2007及B/Wisconsin/01/2010;Victoria 系1B 与1A 分 支 参 考 株 是B/Hong Kong/514/2009 及B/Brisbane/60/2008[12]。从NCBI的Genbank 和全球共享禽流感数据倡议组织平台下载其余参考序列:B/Hong Kong/330/2001 (2002 - 2004 年 疫 苗 株,V 系)、B/Shanghai/361/2002 (2004-2006 年 疫 苗 株,Y系)、B/Malaysia/2506/2004 (2006-2007年疫苗株,V 系)、B/Yamagata/16/88 (Yamagata 系 代表株)、B/Victoria/2/87 (Victoria系代表株)和部分不同来源地的参考毒株。为避免偏差,所有序列截取相同长度的区段。

表1 乙型流感病毒HA 和NA 基因的引物序列

2 结果

2.1 乙型流感病毒的分离扩增和鉴定 分离扩增2017-2018年乙型流感病例咽拭子标本共40份,成功分离出38 株,初步鉴定出Yamagata 系28株,Victoria系10株,Yamagata系毒株占乙型流感毒株的73.68%。

2.2 乙型流感病毒HA、NA 基因遗传进化分析 对38株乙型流感病毒进行HA、NA 测序并构建分子进化树(图1)。

2.2.1 HA 进 化 分 析 28 株 乙 型 流 感 病 毒Yamagata系毒株的HA 基因均属于Yamagata Clade 3分支,并且与疫苗株B/Phuket/3073/2013属于同一亚支,还有一个亚支为B/Wisconsin/01/2010类似株;10株乙型流感病毒Victoria系毒株均属于Victoria Clade 1A 分支,其中以B/Hong Kong/286/2017 和B/Norway/2409/2017 为 代 表的进化亚支Clade 1A (▲1、▲2)[13]中未出现广州市病毒株。

2.2.2 NA 进化分析 28株Yamagata系乙型流感病毒中有27株的NA 基因属于Yamagata Clade 3分支,并且与疫苗株B/Phuket/3073/2013 属于同一亚支;10株乙型流感病毒Victoria系毒株均属于Victoria Clade 1A 分支,以B/Norway/2409/2017为代表的进化亚支Clade 1A (▲2)中未出现广州市病毒株,以B/Hong Kong/286/2017 为代表的进化亚支Clade 1A (▲1)中出现广州市病毒株。另 外, 发 现1 株 Yamagata 系 病 毒 B/Guangdong/GZ20/2018 的NA 基因属于Victoria系,而 HA 基因属于Yamagata 系,因此B/Guangdong/GZ20/2018毒株是BY-HA/BY-NA 系间重配病毒。

2.3 乙型流感病毒HA、NA 基因分子特性分析

2.3.1 HA 分子特性分析 28株Yamagata系病毒株同本年度WHO 推荐的疫苗株B/Phuket/3073/2013相比较,HA1共有11个氨基酸位点发生变异(表2),27株均携带L187Q 和M266V 突变,重配株B/Guangdong/GZ20/2018也携带同样的突变;另外还发现S93P、R151K、N179K、P342S、V421A、N436S、T547I 的氨基酸突变,但仅涉及个别毒株,且V421A、N436S 和T547I突变位点位于 HA2 基因结构域上,B/Guangdong/GZ14/2018毒株缺失第540位氨基酸,B/Guangdong/GZ40/2018毒株发现T136I位点突变,位于120 环抗原表位上。10 株Victoria系病毒株同本年度WHO 推荐的疫苗株B/Brisbane/60/2008相比较,HA1 共有7 个氨基酸位点发生变 异 (表3),10 株 均 携 带I132V、N144D 和A214T 突变,其中I132V 位于抗原表位120环上,N144D位于抗原表位150环上;另外还有A169T、K227R、N248D 和P343S的变化。

图1 2017-2018年广州市乙型流感病毒HA 和NA 基因进化树

2.3.2 NA 分子特性分析 27株Yamagata系病毒株同本年度WHO 推荐的疫苗株B/Phuket/3073/2013相比较 (表4),26 株 (96.3%)携带I49M 突变,19株 (70.4%)携带R65H 突变,24株(88.9%)携 带I171M 突 变,25 株 (92.6%)携带D342K 突变,同一位点的另外2株病毒株B/Guangdong/GZ16/2018 和 B/Guangdong/GZ34/2018携带D342N突变,27株(100.0%)均携带K373Q 突 变,17 株 (63.0%)携 带S402P 突 变;另 外 发 现I6T、F12L、V45I、P48S、A67V、A67T、G70E、P76L、N144S、R186I、F266L、E308G、R315K、T372N、T389I、K419E、T437I等位点的变化,但仅发生于个别毒株。11 株Victoria系病毒株同本年度WHO 推荐的疫苗株B/Brisbane/60/2008 相比较 (表5),均携带I120V、K220N、S295R、N340D、E358K 突变,重配株B/Guangdong/GZ20/2018同样携带以上突变;8 株 (80.0%)携 带 D384G 突 变;3 株(30.0%) 携 带 V401I 突 变, 重 配 株 B/Guangdong/GZ20/2018同样携带此位点突变;另外发现了P48T、T106I、I262M、M369V、V422I等位点突变,但仅发生于个别毒株。

3 讨论

乙型流感病毒具有交叉流行和几乎不可预测的特征,因而时常导致WHO 推荐的流感疫苗与当地流行的乙型流感病毒谱系无法完全匹配[14]。根据流感监测数据显示,2017 年12 月至2018 年4月广东省广州市乙型流感病毒为流感优势株,Yamagata 和Victoria 2 种谱系共同流行且以Yamagata系为主要优势株,而2017-2018 年度WHO 推荐的是包含Victoria系毒株B/Brisbane/60/2008的三价疫苗株,可见该疫苗株与广州市流行的乙型流感病毒的匹配度不高,降低了疫苗的保护效果。因此,三价疫苗未能产生交叉保护作用有可能是造成广州市该年度Yamagata乙型流感病毒暴发的一个重要原因;另外,疫苗接种率低也是潜在原因之一。四价流感疫苗已于2018年4月在我国大陆批准上市,因此国家应该加速推动四价流感疫苗的普及,提高流行株与疫苗株的匹配度,为人群的身体健康提供有效保护,尤其是老人和小孩等免疫力较为低下的人群,减少国家的经济损失,减轻疾病负担[15]。

表2 Yamagata系毒株HA 氨基酸发生替代的位点

表3 Victoria系毒株HA 氨基酸发生替代的位点

本次实验所测的广州市流行的乙型流感病毒株的HA 基因均处于Yamagata 系的Clade 1 和Victoria系的Clade 1A 分支中,但未出现 “阶梯样”进化特征,可能是因为所测样本之间的时间间隔较短。而且,本研究中发现系间重配病毒,Yamagata系毒株的NA 基因属于Victoria系。研究发现,系间重配和系内重配是乙型流感病毒变异进化的主要机制之一,而且容易造成大流行,可能是因为重配导致病毒的抗原发生变化,而人群的免疫系统缺乏相应的保护功能,从而导致大流行[16]。

研究表明,乙型流感病毒的HA1基因结构域上有4个主要的抗原表位,即120环(HA1 116～137)、150 环 (HA1 141～150)、160 环 (HA1 162～167)和190螺旋(HA1 194～202)。抗原表位区域内的氨基酸位点发生变异往往会影响病毒的抗原性和病毒株的进化方向[17]。10株Victoria系病毒株均发生I132V 和N144D 的变化,涉及120环和150环2个抗原表位,28株Yamagata系病毒株仅有B/Guangdong/GZ40/2018毒株发生T136I的突变,涉及120环抗原表位。这些突变是否引起抗原性改变仍需进一步深入研究。

表4 Yamagata 系毒株NA 氨基酸发生替代的位点

表5 Victoria系毒株NA 氨基酸发生替代的位点

NA 蛋白的酶活性位点对维持神经氨酸酶活性稳定起着非常重要的作用[18]。据文献报道,乙型流感病毒NA 蛋白上存在E117、D149、R223、E275、R374、Y409 等11 个酶活性位点[19-20]。酶活性位点突变可以降低病毒对神经氨酸酶抑制剂类抗流感药物的敏感性,而不同的突变位点会导致对不同抗流感药物产生耐药性,比如E117位点的突变会降低病毒对奥司他韦、扎那米韦的敏感性,R150位点的变异会使病毒对奥司他韦、扎那米韦和帕拉米韦都产生耐药性[21-24]。本研究中的38株乙型流感病毒均未发现上述位点的突变,表示对神经氨酸酶抑制剂敏感,表明广州地区使用的常规抗流感药物可以发挥抗流感作用。10 株Victoria系病毒株和重配株B/Guangdong/GZ20 在第220 位氨基酸均发生K220N 的变化。2006-2007年中国台湾暴发乙型流感正是由于220、320和404位氨基酸发生变化而引起[25]。

综上所述,2017-2018年度WHO 推荐的三价流感疫苗株未能对广州市人群形成良好的保护作用,因此需密切关注乙型流感病毒的变异情况以及和疫苗株的匹配度,以便及时制定合理的疫苗更新和接种方案,对流感进行科学有效的防控。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突