基于浙江北部及上海天蛾科昆虫COI 基因的分类系统研究

杨行健，胡 懿，顾 妍，蒋卓衡，何祝清

（1. 华东师范大学 第二附属中学（张江校区），上海 201203；2.生物学青少年实践工作站，生命科学学院，华东师范大学，上海 200241；3.华东师范大学第二附属中学（紫竹校区），上海 200241；4.苏州工业园区星海实验中学，江苏 苏州 215100；5.南京紫金山昆虫博物馆，江苏 南京 210000；6.生物博物馆，生命科学学院，华东师范大学，上海 200241；7.长江三角洲河口湿地生态系统教育部和上海市野外科学观测研究站，华东师范大学，上海 200241）

天蛾科Sphingidae 隶属于鳞翅目Lepidoptera 蚕蛾总科Bombycoidea，全世界包括200 多个属，1 400 余种，遍布除南极洲外的各个大陆[1]。天蛾（天蛾科昆虫的统称）是重要的农业昆虫，成虫在传粉上有重要作用，但是幼虫又大量取食各种农作物。由于其个体大、便于采集、种类多，是用于研究形态功能学[2]、协同进化[3-4]、生物地理学[5]等的良好材料。

然而，这些研究都需要建立在可信的系统发育学的研究基础之上。早期的系统发育研究主要体现在高级阶元（亚科、族）的划分。Rothschild 等最先为天蛾科物种作科学化的分类，分为感毛组与无感毛组两大组，下设五亚科七族[6]。朱弘复和王林瑶编写的《中国动物志昆虫纲第11 卷鳞翅目天蛾科》（以下简称动物志）中[7]，其分类系统的参考即是该体系，之后国内多数有关天蛾的研究也多沿袭《动物志》中五亚科分类系统[8-14]。随着分子生物学的发展，采用分子标记重建系统发育树的研究随之展开。然而，这些研究或者个体较少，或者仅研究某属或某族，缺乏整体性的把握[15-17]。直到2009 年，Kawahara 等通过测序131 种天蛾的5 个编码核基因（6 793bp），重建了全球范围内的天蛾系统发育关系，确立了三亚科分类体系，其下共设八族[1]。

本研究基于中国浙江北部及上海市的天蛾标本，以COI基因为分子标记，重建了系统发育树，比较了Kawahara 和朱弘复等提出的2 种分类系统的异同。

1 材料和方法

1.1 研究材料

试验样品于2016 年和2019 年6-8 月采集自浙江北部的桐庐天子地生态风景旅游区、天童山国家森林公园、清凉峰国家级自然保护区及上海的金山区增丰村、崇明区陈家镇、闵行区华东师范大学校区。采集方法包括灯诱法、网捕法和饲养法。其中，盾天蛾指名亚种Phyllosphingia dissimilis dissimilis样品2，3，6 为土中挖掘得到的蛹，后羽化成虫，福瑞兹长喙天蛾Macroglossum fritzei样品2，3为扫网所得，其余样品均为夜晚灯诱采集。其中，在桐庐样点设置了4 个诱灯，每3 h 采集一次。采集到的天蛾采用75%医用酒精注射腹部致死，取2～ 3 条后足保存于无水乙醇中，并将后足及标本对应编号。将取足后的天蛾置于三角包中室温通风保存，用于制作干制标本及形态鉴定。本次研究共采集到天蛾样品94 只，共计31 种；另有2 种蚕蛾（柞蚕Antherea pernyi及华尾大蚕蛾Actias sinensis）作为系统发育分析的外群，见表1。

图1 采集的天蛾部分种类标本Figure 1 Some collected Sphingidae

1.2 DNA 提取及COI 基因扩增

采用AxyPrep Genomic DNA Miniprep Kit (AXYGEN)试剂盒对各样品DNA 进行提取。COI基因扩增PCR采用Taq PCR Master Mix 酶，引物采用LCO1490（5’-GGT CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3’）和HCO2198（5’-TTA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3’），由铂尚生物技术（上海）有限公司合成，PCR 反应条件为：预变性94℃ 2 min，变性94℃ 30 s，退火45℃ 30 s，延伸72℃ 30 s，终延伸72℃ 7 min，循环30 次。PCR 产物送交铂尚生物技术(上海)有限公司进行双向测序。各样品GenBank 号详见表1。

表1 样品采集信息及GenBank 号Table 1 Samples collected and GenBank number

表1续

1.3 系统发育分析

对测序结果，首先采用Bioedit 软件对COI基因的峰图进行筛选，对有双峰或底峰的序列需要重新进行PCR的扩增及测序，查找问题。而结果准确的双向测序序列则利用ATGC7 软件进行拼接，并将拼接后的序列导入MEGA7 软件进行ClustalW 比对，去掉左右的引物序列，得到658bp 的基因序列，将其以FASTA 文件格式保存并输出。本研究选用最大似然法（Maxiumum likelihood，ML）对COI基因片段进行系统发育树的构建，基于GTR 模型进行1 000 次分析（Bootstrap value），最终构建ML 系统发育进化树。

2 结果与分析

研究测得了全部96 个样品的COI基因片段（658bp），将其重建系统发育树，如图2。由图1 可知，天蛾科是个单系群，同种同属全部各自聚在一起，后验概率全部 > 95%（平背天蛾除外，采集自桐庐的4 个平背天蛾个体各自聚为2 小支）。天蛾科首先分为2 大支A 和B。A 支包括六点天蛾属Marumba，鬼脸天蛾属Acherontia，大背天蛾属Meganoton，白薯天蛾属Agrius，霜天蛾属Psilogramma，锯翅天蛾属Langia，星天蛾属Dolbina，鹰翅天蛾属Ambulyx，豆天蛾属Clanis，构月天蛾属Parum，锤天蛾属Neogurelca，盾天蛾属Phyllosphingia，其中大背天蛾属，白薯天蛾属，霜天蛾属亲缘关系较近，其余相互关系不明确。B 支分为2 小支，一支包括长喙天蛾属Macroglossum，缺角天蛾属Acosmeryx；另一支包括葡萄天蛾属Ampelophaga，灰天蛾属Acosmerycoides，背线天蛾属Cechetra，斜纹天蛾属Theretra，白肩天蛾属Rhagastis，红天蛾属Deilephila。。

图2 基于COI 基因（658bp）的浙江北部及上海天蛾科昆虫系统发育关系图Figure 2 Phylogenetic relationship of Sphingidae from northern Zhejiang and Shanghai based on COI genes (658bp)

3 结论与讨论

3.1 COI 用于物种鉴定的有效性

Hebert 等在2003 年首次提出了DNA 条形码的概念[18]。虽然DNA 条形码的研究仍存在一定的争议，但其在动物分类学中的研究已相对成熟，并将COI基因选取作为动物界标准鉴定基因。COI基因位于线粒体内，参与线粒体细胞色素C 氧化酶(Cytochrome C oxidase)第一亚基的编码，未发现内含子。该基因理论上分布于一切有氧呼吸的真核生物体内，其遗传模式呈典型的母系遗传[19]。相对于12S 和16S 等mt-rDNA，COI基因具有较少的插入和缺失现象，分子进化形式以点突变为主，有利于提高序列比对结果的可靠性，对于区分属以下的分类单元而言具有足够的分辨能力。该技术在发现和描述新种或隐种、种类分子鉴定、系统发育等研究中广泛应用[20]。在同种之间，COI基因序列几乎一致，而不同种之间随着亲缘关系的疏远而变异加大。徐淼锋等通过测序进口水果中的幼虫COI基因，发现其为苹果异胫小卷蛾Cryptophlebia leucotreta[21]。陈秀洁等通过COI基因能够很好地区分四种粘虫Mythimna separata的近缘种[22]。和淑琪等利用COI基因对于新西兰苹浅褐卷蛾Epiphyas postvittana研究发现，同种间序列差异小于3%[23]。陈珊等研究发现巨疖蝙蛾Phassus giganodus 的卵、幼虫、成虫的COI基因具有高度一致性[24]。本研究共计测序了32 种天蛾的94 个个体，同一物种间的COI基因几乎一致，如大背天蛾指名亚种采集自浙江桐庐、天童山及清凉峰三个地区，但其序列差异小于1%，进一步证实了COI基因用于鉴定动物物种的可靠性。

3.2 通过COI 基因探讨系统发育关系

由于COI基因快速突变的特点，不少研究将其用于生物地理学或系统发育等相关研究。如李玉婷等基于COI基因研究发现，其能够较好地对苹果蠹蛾Cydia pomonella的种群分化进行标记[25]。而卢慧通过COI基因对中国蛉蟋科Trigonidiidae 构建系统发育树发现，属种水平上支持率较高，而高阶上的支持率较低[26]。同样，基于COI基因在对鳞翅目Lepidoptera、双翅目Diptera、直翅目Orthoptera 等构建系统发育树也发现，同种及同属间具有较高的支持度，而族、亚科等相互间的系统关系得不到很好的解析[27-30]。

对于天蛾科昆虫的系统发育研究主要体现在高级分类阶元的划分。在《动物志》中，中国天蛾科被划分为5 亚科（面形天蛾亚科Acherontiinae、云纹天蛾亚科Ambulicinae、透翅天蛾亚科Sesiinae、蜂形天蛾亚科Philampelinae 和斜纹天蛾亚科Choerocampinae），而由Kawahara 等认为天蛾科分为长喙天蛾亚科Macroglossinae、目天蛾亚科Smerinthinae、天蛾亚科Sphinginae，蒋卓衡在对于中国长喙天蛾属及斜纹天蛾属研究中也参照此系统[31]。两种分类系统之间，长喙天蛾亚科=蜂形天蛾亚科+斜纹天蛾亚科+透翅天蛾亚科，而Kawahara 的目天蛾亚科、天蛾亚科与《动物志》的蜂形天蛾亚科和斜纹天蛾亚科既有重叠的部分，又有相互矛盾的部分。

本研究首次采用COI基因，对中国浙江北部地区及上海市的天蛾科系统发育进行了研究。在A 支中，两种分类系统的分歧点是星天蛾属的亲缘关系问题。本研究结果显示星天蛾属更接近锯翅天蛾属、霜天蛾属、白薯天蛾属和大背天蛾属，这与《动物志》中将这些归为面形天蛾亚科更吻合。除上述5 属外，其余属无论在Kawahara的目天蛾亚科还是《动物志》的云纹天蛾亚科均为并系类群。最后，喜马锤天蛾无论在上述2 个分类系统中均属于B 支，但本研究结果支持其在A 支中。在B 支中，Kawahara 等将其全部归为长喙天蛾亚科，而《动物志》将其分为斜纹天蛾亚科和蜂形天蛾亚科（本研究未涉及透翅天蛾亚科）。根据葡萄天蛾属和灰天蛾属的系统关系，《动物志》所提出的二亚科非单系群。

综上所述，本研究发现COI基因能够很好地鉴定不同种类的天蛾，且不同产地的同一物种具有极高的序列相似性；系统发育结果表明天蛾分为2 大支，其分类结果各支持上述两种分类系统的部分结果，但在A 支中属与属之间的拓扑结构的后验概率均不高，不能很好地明晰各属间相互关系，在今后的研究中应采用多基因建树，或者系统发育基因组学对天蛾科的演化关系进行更为深入的研究。