叶面喷施S-烯丙基-L-半胱氨酸对晚稻籽粒中铅含量的影响

程六龙，黄永春*，周桂华，刘仲齐，张长波，王常荣，王晓丽

（1.农业农村部环境保护科研监测所，天津300191；2.广西兰池环保科技有限公司，南宁537000）

人类工、农业生产活动直接或间接地向环境中排放了大量含铅（Pb）污染物，其中大部分留存于土壤表层[1]。农田土壤中的Pb 可以通过土壤-植物-食物的传递过程最终转移到人体内[2]，通过体内循环系统分布到肝脏、肾脏和肺等多个器官并在这些器官中逐步蓄积，从而给人体健康造成潜在风险。20 世纪80年代，有关Pb 摄入对儿童神经系统影响的研究被大量报道后，Pb 污染问题开始受到世界各国科学家的广泛关注[3]。2006年，国际肿瘤研究协会（IARC）进一步将无机Pb 及其化合物划分为2A 类致癌物（可能对人体具有致癌活性）[4]。鉴于Pb 对人体的毒害作用，世界各国都对食品中Pb含量制定了相关限量标准。

水稻是世界上最重要的粮食作物之一，种植范围覆盖全球100 多个国家。全球超过一半的人口以稻米为主粮，稻米为全球人口提供了21% 的总摄取热量，而在东南亚地区这一占比甚至高达76%[5]。稻米中的Pb 主要来源于水稻根系从土壤中吸收的Pb，小部分可能来源于大气降沉到水稻叶面的Pb[6]。为保护人体健康，我国国家食品安全限量标准（GB 2762—2017）规定大米中的Pb 含量不得高于0.2 mg·kg-1。为降低水稻籽粒中的Pb含量，目前已开发出多种农艺措施，如使用有机或无机改良剂[7]、水分调控[8]、肥料利用[9]都可以起到降低水稻籽粒中Pb 含量的作用。此外，也有报道表明叶面喷施矿质营养元素如硅（Si）、硒（Se）也可以降低水稻籽粒中的Pb 含量[10]。随着无人机喷施技术的快速发展，叶面喷施技术的田间应用成本迅速降低，这使得该技术的大面积推广应用成为可能。近年来，叶面喷施技术在水稻重金属污染防治，尤其是镉（Cd）污染防治方面已经成为研究热点[11]，并显示出良好的应用前景。但是，重金属叶面阻控剂的研究主要集中在对无机元素的筛选与利用方面，而对有机化合物尤其是含硫化合物的报道较少。本研究选择Pb含量较高的水稻田块作为试验区，研究了叶面喷施S-烯丙基-L-半胱氨酸（SAC）对水稻籽粒中Pb含量的影响。

SAC是大蒜提取物中的一种天然有机硫化合物，其对保障人体健康具有诸多益处，包括预防心血管疾病、肝脏疾病和神经发育系统疾病[12-13]。此外，还有报道表明SAC 可显著降低Pb2+对红细胞的毒性，延长暴露于Pb2+环境中的红细胞寿命[14]。SAC结构中含有一个二硫键，其断裂后形成的巯基可与Cd、As、Pb 等重金属形成稳定的螯合物，缓解重金属对植物和人体造成的毒害[15]。在医疗上，针对Pb2+中毒通常采用2，3-二巯基丁二酸（DMSA）进行螯合法治疗[16]。我们前期研究表明，于水稻开花期叶面喷施DMSA 可以显著降低累积在营养器官尤其是旗叶中的Cd2+向籽粒中迁移，显著降低籽粒Cd 含量[17]，显示出巯基重金属螯合剂在降低稻米重金属含量方面具有巨大的潜在应用价值。有研究表明，SAC在缓解重金属毒性方面甚至优于DMSA[18]。本研究分别于水稻孕穗期和开花期各喷施一次SAC，主要探究：（1）叶面喷施SAC对水稻籽粒Pb含量的影响；（2）叶面喷施SAC 对水稻籽粒中人体必需矿物营养元素（K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn）含量的影响；（3）叶面喷施SAC 对Pb在水稻体内迁移转运的影响。

1 材料与方法

1.1 试验地点与试验材料

试验区选在广西壮族自治区桂平市（23°24′N，110°03′E），试验所选稻田位于某小型废弃铅锌矿下游。试验田土壤类型为水稻土，其理化性质如表1所示。

水稻品种选用当地主栽优质稻品种“百香139”，种子购于当地种子公司。S-烯丙基-L-半胱氨酸（SAC）为分析纯，购于国药集团。

1.2 试验方法

水稻于2019 年6 月12 日开始育秧，幼苗于2019年7月26日移植。小区面积设定为10.0 m2（长5.0 m、宽2.0 m）。采用当地传统生产管理方法进行田间管理，采用化学除草剂除草，喷施化学农药进行田间防病、防虫。

称取适量的SAC溶于田间灌溉水中，并加水稀释至1.0 L，配 制 成0.05、0.1、0.2、0.3 mmol · L-1和0.4 mmol·L-1的SAC水溶液，另设不加SAC的处理作为对照（CK），每个处理3 次重复。分别于2019 年8 月15日、8 月23 日水稻孕穗期和开花期阶段，用手持式喷雾器将SAC水溶液均匀喷洒于水稻植株的叶片表面，全生育期内共喷施2次。

表1 水稻种植前表层土壤的物理化学特性Table 1 The physicochemical properties of the top soils before planting rice

1.3 样品的采集与处理

于水稻成熟期，每个小区随机取3 株水稻完整植株。室温自然晾干后，用剪刀将根系与地上部植株分开，将地上部植株分为籽粒、穗轴、第一节间、旗叶、第一节、第二叶、第二节、第二节间、第三节间，共10 个部分。去离子水冲洗3次，70 ℃下烘干72 h。

籽粒用砻谷机脱壳后获得糙米，用万能粉碎机磨成粉末，备用。

地上部植株样品及根系样品经剪刀剪碎后，用万能粉碎机磨成粉末，备用。

1.4 土壤理化性质的测定

于水稻种植前，采用多点随机取样法采集试验区土壤样品，常温下风干，磨碎过0.15 mm 筛，参照文献报道方法测定土壤理化性质和土壤中重金属的含量[19]。简述如下：用pH 计测定土壤的pH 值，用滴定法测定土壤有机质，用NH4OAc 法测定阳离子交换量（CEC）。消解后土壤样品用ICP-MS（ICP-MS，Agilent 7500a，USA）测定Pb和其他金属元素含量。

1.5 糙米及植株样品中Pb及矿质营养元素的测定

分别于消解管中称取磨成粉末后的植物样品约0.25 g，加入7 mL MOS 级浓硝酸浸泡8 h，将消解管放入电热消解仪（Digi Block ED54）进行消解，110 ℃加热消解2.5 h后冷却至室温，加入1 mL过氧化氢摇匀，110 ℃继续加热1.5 h，最后于170 ℃将消解管内的液体浓缩至0.5 mL 以内，去离子水稀释至10 mL 后转移至25 mL 容量瓶中并定容，用ICP-MS 测定消解液中Pb 以及矿质营养元素K、Ca、Mg、Fe、Mn、Zn 的含量。本测定方法对7 种元素的回收率为95%～105%，检出限为0.3～5.5 µg·kg-1。

1.6 数据统计与分析

采用Microsoft Excel 进行相关数据计算与处理。利用SPSS 22.0 进行统计分析，用极差法（Duncan′s）进行多重比较、差异显著性检验。利用Origin 2019作图。

2 结果与分析

2.1 喷施SAC 对水稻籽粒及不同营养器官Pb 含量的影响

利用ICP-MS 测定水稻籽粒和其他器官中Pb 含量，结果如图1A 和图2所示。由图1A 和图2可见，随着SAC 喷施浓度的增加，籽粒中Pb 含量呈现出逐渐降低的趋势。当SAC喷施浓度为0.05 mmol·L-1时，水稻籽粒中Pb含量与对照无显著差异；当SAC叶面喷施浓度达到0.1 mmol·L-1时，水稻籽粒中Pb 含量与对照相比出现显著降低，降幅高达34.04%；当SAC 喷施浓度继续升高直至0.4 mmol·L-1时，籽粒中Pb 含量均未出现持续显著降低的趋势。综上可见，叶面喷施0.1 mmol·L-1的SAC即可显著降低水稻籽粒中Pb含量。

水稻各营养器官中Pb 含量的变化趋势如图1B～图1J和图2所示。由图1B和图2可见，当SAC喷施浓度为0.05 mmol·L-1时，与对照相比穗轴中Pb 含量变化不显著；当SAC喷施浓度达到0.1 mmol·L-1时，穗轴中Pb含量出现显著降低，降低幅度达到49.71%；随着SAC 喷施浓度持续增加，穗轴中Pb 含量出现显著增加趋势，但是当SAC 喷施浓度超过0.3 mmol·L-1后穗轴中Pb 含量增加趋势不显著；当SAC 喷施浓度达到最高的0.4 mmol·L-1时，穗轴中Pb 含量与对照相比降低30.58%。地上部其他器官中Pb含量变化趋势与穗轴中Pb 含量变化趋势类似，均表现为SAC 喷施浓度大于0.1 mmol·L-1时，器官中Pb 含量反而出现持续升高趋势。

图1 水稻籽粒及不同器官中的Pb含量Figure 1 The Pb concentration in grains and organs

图2 喷施SAC对水稻各器官中Pb含量的影响Figure 2 Effect of spraying SAC on Pb content in rice organs

由图1H 和图2 可见，水稻植株地上部顶端第二节中的Pb含量最高，对照组Pb含量为53.19 mg·kg-1，喷施0.1 mmol·L-1SAC 后，Pb 含量下降44.90%；其次是第一节（图1E、图2），对照组Pb 含量为32.14 mg·kg-1，喷 施0.1 mmol · L-1的SAC 后 ，Pb 含 量 下 降 了47.73%；第三节间（图1I、图2）中Pb含量排第三，对照组Pb 含量为29.60 mg·kg-1，喷施0.1 mmol·L-1的SAC后，Pb 含量下降22.16%；第二节间（图1G、图2）Pb 含量低于第三节间，第二节间中对照组Pb 含量为22.09 mg · kg-1，喷 施0.1 mmol · L-1SAC 后 ，Pb 含 量 下 降59.85%。旗叶（图1C、图2）中Pb 含量排第五，对照组Pb 含量为14.41 mg·kg-1，喷施0.1 mmol·L-1SAC 后，Pb 含量下降44.21%。第二叶（图1F、图2）Pb 含量次于旗叶，对照组Pb 含量为12.44 mg·kg-1，喷施0.1 mmol·L-1SAC 后，Pb 含量下降40.03%。第一节间（图1D、图2）Pb 含量小于第二叶，对照组Pb 含量为5.35 mg · kg-1，喷 施0.1 mmol · L-1SAC 后 ，Pb 含 量 下 降59.81%。根系（图1J、图2）中Pb 含量最高，喷施不同浓度SAC对根系Pb含量无显著影响。

2.2 喷施SAC对籽粒中6种矿质营养元素含量的影响

由图3可见，水稻籽粒中矿质营养元素K、Mg、Ca含量远高于Mn、Fe、Zn 含量，且K 含量最高。叶面喷施SAC 对籽粒中K、Mg、Ca、Fe、Zn 5 种人体必需营养元素含量无显著影响，但显著降低了籽粒中Mn 的含量。当SAC喷施浓度达到0.1 mmol·L-1时，籽粒中Mn含量即出现显著降低，与对照相比降低幅度达到21.93%，但是随着SAC 喷施浓度的持续增加，籽粒中Mn含量并未出现持续显著降低趋势。

2.3 喷施SAC对水稻不同器官间Pb转移系数的影响

由图4A可见，喷施0.1 mmol·L-1的SAC显著增加了Pb 由穗轴到籽粒的转移系数（TF籽粒/穗轴），增加幅度达到22.40%，随着SAC 喷施浓度的增加，TF籽粒/穗轴表现出逐渐降低趋势，当SAC浓度达到0.3 mmol·L-1时，TF籽粒/穗轴降低至与对照无显著差异。与之相似，喷施0.1 mmol·L-1的SAC 也显著增加了Pb 由第一节间到穗轴的转移系数（TF穗轴/第一节间），增幅为25.35%，但是随着SAC 喷施浓度继续增加，各喷施浓度间TF穗轴/第一节间增加幅度差异不显著。

由图4B 可见，喷施0.1 mmol·L-1的SAC 显著增加了旗叶到籽粒的转移系数（TF籽粒/旗叶），增加幅度达到16.35%，但是随着SAC 喷施浓度继续增加，TF籽粒/旗叶也表现出逐渐降低的趋势。喷施SAC 对Pb 由第二节间向第一节的转移系数（TF第一节/第二节间）无显著影响。

图3 水稻籽粒中矿质元素含量Figure 3 The mineral element content in rice grain

图4 不同器官间Pb的转移系数Figure 4 Pb transfer factor between different organs

由图4C 可见，喷施SAC 对Pb 由第二节向第二节间的转移系数（TF第二节间/第二节）和由第二节向第二叶的转移系数（TF第二叶/第二节）均未造成显著影响。

由图4D 可见，喷施SAC 显著降低了Pb 由第三节间向第二节的转移系数（TF第二节/第三节间），最高降低幅度达到29.77%，而且0.1～0.4 mmol·L-1SAC 喷施浓度间的TF第二节/第三节间并未表现出显著差异。与之相似，喷施SAC 后Pb 由根向第三节间的转移系数（TF第三节间/根）也 出 现 显 著 降 低 ，最 高 降 低 幅 度 达24.26%，随着SAC 喷施浓度升高，TF第三节间/根也出现升高趋势，但是当SAC 喷施浓度达到最高0.4 mmol·L-1时，TF第三节间/根仍与对照存在显著差异。

3 讨论

在目前已开发的降低水稻籽粒重金属含量的农艺调控措施中，叶面喷施技术与土壤固化技术、植物修复技术、水肥调控技术等相比，具有操作简单、价格低廉的优点。特别是无人机喷施技术在我国广泛应用的背景下，叶片喷施技术的成本进一步大幅降低。目前叶片喷施技术在降低水稻籽粒中Cd含量研究方面取得了众多研究成果。多项研究表明，在营养生长或生殖生长阶段喷施Si[20]、Se[21]、Zn[22]等矿质元素可以有效降低水稻籽粒中重金属Cd 含量。同时，有研究表明叶面喷施技术也可显著降低籽粒中Pb 的含量[23]。当前叶面阻控剂有效成分的筛选研究主要集中在筛选不同的矿物质营养元素，通过离子拮抗机制降低有毒重金属元素被转运进水稻籽粒中[24]。该类重金属叶面阻控剂不仅可以显著降低水稻籽粒中重金属含量，而且还具有二次环境污染风险较低的优点。此外，杨晓蓉等[17]报道，叶面喷施巯基重金属螯合剂二巯基丁二酸（DMSA），通过在营养器官中与Cd2+形成螯合物也可显著降低水稻籽粒中Cd含量，表明含硫巯基化合物可能是一类新型高效重金属叶面阻控剂。

本研究分别在孕穗期和开花期叶面各喷施一次，含硫化合物SAC 显著降低了水稻籽粒中Pb 含量，而且仅喷施浓度为0.1 mmol·L-1的SAC即可使水稻籽粒中Pb 含量显著降低34.04%。在水稻营养生长阶段，从根部吸收的重金属被转运到地上部营养器官如叶片、节间、节等中，在生殖生长阶段储存在营养器官中的重金属随营养物质一起被转运进籽粒[25]。于水稻灌浆期喷施含硫的巯基化合物DMSA，其通过与Cd2+形成螯合物显著降低了Cd 向籽粒中的迁移[17]。本研究中喷施0.1 mmol·L-1的含硫化合物SAC后也显著降低了水稻籽粒中Pb 含量，但是随着SAC 喷施浓度的继续增加并未出现籽粒中Pb 含量持续降低的趋势，Pb 由旗叶向籽粒中的迁移系数（TF籽粒/旗叶）反而增加。上述结果表明，喷施SAC 降低籽粒中Pb 含量的机制不同于喷施DMSA，预想的SAC 化学结构中含有的二硫键断裂形成巯基，巯基与Pb 形成螯合物降低Pb2+向籽粒中的移动性并不是导致籽粒中Pb含量降低的主要原因。

有研究表明SAC 是一种重要的细胞转录因子调控剂，它在细胞内可以激活调控细胞抗氧化系统的Nrf2 转录因子，使细胞大量合成抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD），清除细胞内由于外界胁迫因素产生的大量自由基[26]。在水稻生殖生长阶段，重金属离子在转运蛋白作用下被运输到水稻籽粒中，对水稻的正常生理代谢过程造成了一定的胁迫效应。喷施低浓度（0.1 mmol·L-1）的SAC很可能起到了调控Pb2+转运蛋白转录的作用，从而降低了籽粒中Pb 含量，但是其详细调控机制仍有待进一步深入研究。

水稻中含有多种人体必需矿质营养元素如K、Mg、Ca、Fe、Mn、Zn 等[27]。这些必需元素在人体中具有重要的生理功能，缺Fe 会导致人体血红蛋白数量降低，免疫力下降；成人缺Zn 可引发尿毒症、贫血等症状，儿童缺Zn 会导致生长迟缓；成人缺Mn 则会导致生殖功能紊乱，幼儿及青少年缺Mn 会导致骨骼畸形、发育不良等[28]。本研究结果表明，喷施SAC 对水稻籽粒中人体必需矿质营养元素K、Mg、Ca、Fe、Zn 的含量没有显著影响，但是在降低籽粒中Pb 含量的同时也显著降低了籽粒中Mn 的含量。有研究表明，重金属Cd 与Mn 在水稻体内共用OsNramp5 转运蛋白，当敲除该转运蛋白编码基因后，水稻籽粒中Cd 和Mn的含量同时出现显著降低[29]。当在水稻开花期叶面喷施巯基化合物DMSA 后，水稻籽粒中Cd 和Mn 也出现同时降低的现象[17]，推测可能与影响OsNramp5 表达有关。关于Pb 在水稻体内的转运蛋白报道较少，本研究中喷施SAC 后水稻籽粒Pb 和Mn 含量出现同时降低现象，是否也与OsNramp5 转运蛋白表达有关需要进一步研究。此外，有研究表明在酿酒酵母中Pb 能与谷胱甘肽形成复合物（GS-Pb），从而缓解了Pb 对酿酒酵母的胁迫作用[30]。在ABCC 转运子的运输下，GS-Pb 复合物被转运进液泡并被分隔在液泡内[31]。在拟南芥的根细胞中也发现了类似过程，Pb与谷胱甘肽结合后可通过AtHMA3转运子转运到液泡，降低了Pb 向地上部的转运[32]。以上研究提示，喷施低浓度SAC 也可能诱发Pb在水稻根系中被运输到液泡内封存从而起到降低Pb 向地上部运输的作用，导致水稻地上部营养器官以及籽粒中的Pb含量均出现显著降低。但是SAC 降低水稻籽粒及营养器官中Pb含量的机制仍需进一步深入研究。

有研究表明，水稻地上部Cd 含量最高的器官位于茎秆顶端第一节，这对阻止Cd 向籽粒中迁移起着重要作用[19，33]。本文对水稻地上部各器官中Pb 含量的研究表明，基部节和节间中Pb 含量表现出高于顶端节和节间中Pb 含量的现象，Pb 在水稻茎中的分布呈现出从基部到顶端逐渐降低趋势。这一现象表明，重金属Pb在水稻体内的运移性低于Cd。

4 结论

（1）分别于水稻孕穗期和开花期各喷施一次0.1 mmol·L-1SAC即可显著降低水稻籽粒中Pb的含量，继续增加SAC 的喷施浓度不会导致籽粒中Pb含量持续降低。

（2）分别于水稻孕穗期和开花期各喷施一次SAC，对水稻籽粒中K、Mg、Ca、Fe、Zn 5 种人体必需营养元素含量无显著影响，但是会显著降低籽粒中Mn元素含量。

（3）喷施SAC 显著降低了Pb 由根向第三节间的转移系数（TF第三节间/根）和由第三节间向第二节的转移系数（TF第二节/第三节间）。