芦笋组培快繁技术研究

詹立平，张建军，赵 鑫

(1.辽宁医药职业学院，辽宁 沈阳 110101；2．辽宁生态工程职业学院，辽宁 沈阳 110101)

芦笋Asparagusofficinalis又名石刁柏、龙须菜，为百合科天门冬属多年生草本植物，是一种药食兼用的高档蔬菜。在药用方面，芦笋具有抗肿瘤、降血脂、提高免疫力等功效[1]，而且这些功效已经得到医学验证，已有几种以芦笋为原料的药品用于临床[2]；在食用方面，芦笋含有丰富的维生素B、维生素A、叶酸以及硒(Se)、铁(Fe)、锰(Mn)、锌(Zn)等微量元素，含有人体所必需的各种氨基酸。芦笋含硒量高于一般蔬菜，在国际市场上享有“蔬菜之王”、“世界十大名菜之一”的美誉[3]。

20世纪60年代末以来，全球芦笋种植面积呈现快速增长趋势。在全球芦笋主产国中，中国的总产量名列第一，中国已成为世界芦笋生产大国[4]。随着芦笋种植产业的迅猛发展，提升芦笋质量、培育芦笋新品种已成为现实需求。目前，芦笋的新品种培育主要集中于全雄育种、多倍体育种以及分子标记辅助育种等方面[5]。组织培养作为植物繁育的有效手段，已经在多种药用植物种苗培育中得到广泛应用。已报道的有关于芦笋组织培养的研究中，多以叶片、茎段作为繁殖材料，但以种子作为繁殖材料的报道较少。

本研究以芦笋种子为试验材料，探究芦笋组织培养过程中愈伤组织诱导、丛生芽诱导以及生根培养的最佳激素配比，从而建立完善的芦笋组培快繁体系。

1 材料与方法

1.1 材 料

从辽宁医药职业学院试验田中选择颗粒饱满的芦笋种子为试验材料。

1.2 方 法

1.2.1 消毒方法

将芦笋种子用流水冲洗2 h，转入超净工作台上，用0.1%升汞分别消毒4、6、8、10 min，无菌水冲洗10次，用消毒滤纸吸干种子表面水分，分别将种子一分为二，接种至附加2%蔗糖、0.7%琼脂、pH值6.0的MS基本培养基中，每个处理50粒种子。培养室温度(25±1) ℃，光照16 h·d-1，光照强度1 500 lx。相对湿度为70%～80%。15 d后统计污染率及萌芽率。

1.2.2 愈伤组织诱导

将经过消毒处理的芦笋种子接种于附加6-BA(1.0 mg·L-1)和NAA(0.1、0.2、0.5、1.0 mg·L-1)的MS培养基中，进行愈伤组织诱导，未添加激素的培养基为对照，每个处理接种10粒种子，重复3次。培养35 d后统计诱导率。

1.2.3 丛生芽的诱导

将愈伤组织接种至MS基本培养基培养1周后，分割成1 cm3大小，转接至附加6-BA(0.1、0.5、1.0 mg·L-1)、NAA(0.05、0.1、0.2 mg·L-1)的MS培养基上，未添加激素的培养基为对照，诱导丛生芽。每个处理接种10块愈伤组织，重复3次，45 d后观察丛生芽诱导情况。

1.2.4 生根的诱导

将丛生芽诱导试验中分化得到的生长旺盛、高度 2 cm以上的丛生芽，分割为每丛3～4株，接种至生根培养基中。基本培养基为1/2MS，附加0.5、1.0、1.5、2.0 mg·L-1的IBA，每个处理接种20株丛生芽，重复3次。30 d后统计生根率、根数以及根长。

1.2.5 移 栽

移栽前，将生根幼苗的培养瓶移入温室，揭掉封口膜，保持自然光照，温度20～28 ℃，相对湿度 90%左右，培养2～3 d。待瓶内长出新鲜的嫩叶后，用镊子轻轻取出小苗，洗去根部培养基，移栽到泥炭土∶河沙=5∶1的基质中，以泥炭土基质为对照。移栽15 d后统计成活率。

1.2.6 数据分析

应用MINITAB 14对试验结果进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 消毒时间对芦笋种子无菌萌发的影响

由表1可以看出，随着消毒时间延长，污染率明显下降，消毒效果显著提升。当消毒时间为4 min时，污染率达到24%；消毒时间为6 min时，污染率下降至10%；当消毒时间等于或超过8 min时，外植体未被污染。但消毒时间过长，升汞会对种子造成毒害，降低种子的萌发率。当消毒10 min时，污染率为0，但萌芽率较消毒8 min降低了10%。因此，芦笋种子表面消毒时间以8 min为宜。

表1 消毒时间对种子萌发的影响

2.2 激素配比对芦笋愈伤组织诱导的影响

研究结果表明，培养4 d后种子开始膨大，7 d后种子陆续发芽，芽苗逐渐长高，20 d后在芽苗基部出现愈伤组织。

由表2可知，适宜的激素质量浓度对芦笋种子愈伤组织诱导有促进作用。添加6-BA 1.0 mg·L-1处理的诱导率最高，愈伤组织质地松软，长势好，色泽翠绿，而添加6-BA 1.0 mg·L-1、NAA 0.5 mg·L-1和6-BA 1.0 mg·L-1、NAA 1.0 mg·L-1的处理未能诱导产生愈伤组织。由此可以看出，随着NAA质量浓度增加，愈伤组织质地由松软到较硬，最后不能形成愈伤组织，说明随6-BA/NAA比值减小，对芦笋愈伤组织诱导产生了抑制作用。

表2 激素配比对芦笋种子愈伤组织诱导的影响

2.3 激素配比对芦笋愈伤组织丛生芽诱导的影响

由表3可知，对照处理没有形成丛生芽；供试的激素配比均能促进芦笋丛生芽增殖，但不同质量浓度的激素配比对芦笋愈伤组织诱导丛生芽存在明显的差异。经多重比较可知，添加6-BA 0.5 mg·L-1、NAA 0.2 mg·L-1处理的芦笋丛生芽平均株高最高，增殖系数最大。

表3 激素配比对芦笋愈伤组织丛生芽诱导的影响

2.4 芦笋丛生芽生根培养

由表4可知，不同生根培养基上芦笋丛生芽的生根率、根数存在显著差异，根长差异不显著。当IBA质量浓度为0.5 mg·L-1时，根较为细弱，生长不佳，不利于芽苗的养分吸收；当IBA质量浓度为1.5 mg·L-1和2.0 mg·L-1时，根系较为粗壮，但芽丛与根系间的愈伤组织过大，在移栽过程很容易在愈伤组织处发生断裂；当IBA浓度质量为1.0 mg·L-1时，根生长健壮，愈伤组织大小适宜，生根率和根数达到最优，因此最适生根培养基为 1/2MS+IBA 1.0 mg·L-1。

表4 IBA质量浓度对芦笋丛生芽生根的影响

2.5 移栽驯化

在外界环境及管理措施相同的条件下，试管苗在泥炭土∶河沙=5∶1的基质上成活率达到82%，且长势良好。而泥炭土为基质的试管苗成活率仅52%，且长势较弱。因此，泥炭土∶河沙=5∶1的基质为芦笋试管苗适宜的移栽基质。

3 讨 论

以芦笋种子为试验材料，采用0.1%升汞消毒8 min，污染率为0，发芽率可达到88%。比较以茎尖和茎段为外植体而出现的高污染率和低成活率[6]，种子消毒具有独特的优势。这是因为种子有种皮的保护，且表面较光滑，消毒剂容易杀灭所携带的微生物。在种子萌发过程中，一方面利用自身的营养成分，一方面摄取培养基中的养分，有利于幼苗的营养供应，更易获得健壮的初代无菌苗。

MS培养基中各元素浓度比例适中，可满足植物的营养和生理需要，本试验选择MS培养基为基本培养基。在植物组织培养中，对丛生芽诱导起重要作用的激素主要是生长素和细胞分裂素。本试验在愈伤组织诱导和增殖过程中，当细胞分裂素6-BA 的质量浓度为1.0 mg·L-1时，愈伤组织松软、生长量多，浅黄带绿，表面具瘤状突起。为了促进芽器官分化，应去除或降低生长素浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。当细胞分裂素 6-BA与生长素 NAA的质量浓度分别为0.5 mg·L-1和0.2 mg·L-1时，株高和增殖系数明显高于其它激素组合。生根培养时，尽量将3～4个芽苗(带少部分愈伤组织)接种在一起进行诱导生根，诱导的根系多且发达。此结果与高建明等[8]对抗茎枯病的芦笋品种进行离体培养的研究结果趋于一致。

此外，芦笋根据嫩茎颜色常分为白芦笋、绿芦笋和紫芦笋[9]，本研究选用的试验材料为绿芦笋，后续研究过程中可针对不同颜色的芦笋品种进行比较，开展品种间的培育研究。