急性胰腺炎患者外周血淋巴细胞亚群的改变及其与自噬、凋亡的关系①

潘 静 覃月秋 梁运轩 宋嗣恩 季 科 徐晨阳 杨复锵 尹毅霞 王 超

(右江民族医学院附属医院消化内科，百色 533000)

急性胰腺炎(acute pancreatitis，AP)是临床常见的急腹症，发病率逐年升高，约20%～30%AP患者为以全身炎症反应综合征和多器官功能衰竭为主要特点的重症AP(SAP)，并发感染及脓毒症，提高AP患者的死亡率。研究表明，AP患者机体免疫功能紊乱，表现为早期机体免疫反应过激及后期机体免疫抑制，而淋巴细胞亚群减少是AP患者机体免疫功能受损的重要原因，但具体机制尚不明确[1-3]。研究表明AP患者机体淋巴细胞自噬、凋亡异常可能是导致淋巴细胞改变的重要原因之一[4,5]。自噬对机体的调节作用具有双面性，正常情况下自噬可以清除、降解多余或损坏的蛋白质和细胞器，维持细胞正常功能。但在炎症及异常氧化应激状态下，自噬被异常激活，过度自噬导致细胞死亡。微管相关蛋白1轻链3(microtubule associated protein 1 light chain 3，MAP1-LC3)是自噬相关基因Atg8的同源蛋白，是自噬信号通路中的主要调节蛋白之一，其水平升高直接反映自噬系统的异常激活[6,7]。在细胞凋亡即Ⅰ型程序性细胞死亡过程中，体内的衰老细胞及异常细胞被机体清除，对多种细胞功能的维持具有重要作用。凋亡相关因子半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(cysteinylaspartate specific proteinase，Caspase-3)是调控细胞凋亡的最重要因子，参与细胞毒性T淋巴细胞的杀伤过程，是细胞凋亡的终末段端剪切酶。研究认为，LC3、Caspase-3水平升高提示自噬、凋亡系统异常激活，与AP发生发展密切相关[6,8,9]。本研究对AP患者淋巴细胞亚群、LC3、Caspase-3水平及自噬率、凋亡率进行测定，初步探讨其淋巴细胞亚群的改变及其与自噬、凋亡的关系。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1研究对象 收集2017年1月至2018年12月我院收治诊断的AP患者73例，其中MAP 25例，男性15例，女性10例，平均年龄(48.56±14.16)岁；MSAP 25例，男性14例，女性11例，平均年龄(48.60±12.65)岁；SAP 23例，男性15例，女性8例，平均年龄(49.52±16.47)岁；选择同期健康志愿者25例作为对照组，男性12例，女性13例，平均年龄(44.32±4.99)岁。记录AP患者年龄、性别、影像学资料、APACHE-Ⅱ评分等信息。AP各组与对照组年龄、性别差异无统计学意义。AP诊断均符合中华医学会消化病学分会2013 年制订的《中国急性胰腺炎诊治指南》的诊断标准[10]。入选患者均无肿瘤、肝肾功能不全、血液系统疾病、心脑血管疾病、自身免疫性疾病等疾病，无妊娠或哺乳期妇女。患者入院24 h内采集外周血。

1.1.2试剂与仪器 淋巴细胞亚群4色直接免疫荧光标记抗体为FITC标记的CD3抗体(85-11-0037-42)、APC标记的CD8 抗体(85-17-0086-42)、Per CP标记的CD19抗体(85-45-0199-42)、PE标记的CD4抗体(85-12-0047-42)，购自eBioscience公司；淋巴细胞凋亡FITC Annexin V Apoptosis Detection KitⅠ(Annexin-V FITC/PI)荧光双染试剂、自噬试剂Autophagy Assay Kit、溶血素均购自美国BD公司；人LC3(m1062954.96)试剂检测盒购自上海酶联生物科技有限公司；人Caspase-3(CSB-E08856h-96T)试剂检测盒购自武汉华美生物工程有限公司；人外周血淋巴细胞分离液购自上海碧云天公司；FACS Calibur流式细胞仪购自美国BD 公司；多功能酶标仪购自美国Thermo Scientific公司。

1.2方法

1.2.1淋巴细胞亚群检测 取EDTA抗凝外周血100 μl，分别加入5 μl CD3 FITC/CD8 APC/CD19Per CP/CD4PE，避光室温孵育15 min；加入1∶9 稀释的红细胞裂解液2 ml，轻微振荡混匀，避光静置15 min，1 500 r/min离心5 min，弃上清，PBS洗涤1次，1 500 r/min离心5 min，弃上清，加入500 μl PBS重悬细胞，1 h内流式细胞仪检测。

1.2.2淋巴细胞凋亡率检测 淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，调整细胞浓度至1×106～ 5×106个/ml；加入Annexin-V FITC、PI各5 μl，避光孵育15 min，加入1×buffer 400 μl重悬细胞，1 h内流式细胞术检测。

1.2.3淋巴细胞自噬率检测 淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，用1×Wash buffer清洗细胞1次，离心弃上清；加入适量的1×Wash buffer重悬细胞，计数并调节细胞浓度至1×106个/ml；加入MDC Stain 100 μl 轻轻混匀，37℃避光孵育15 min，加入Collection buffer 400 μl重悬细胞，1 h内流式细胞仪检测。

1.2.4血清LC3、Caspase-3水平检测 ELISA试剂盒检测血清LC3、Caspase-3水平，严格按照说明书操作，绘制标准曲线，求解回归方程，根据样品吸光度值及标准曲线计算各样品细胞因子浓度。

2 结果

2.1外周血T淋巴细胞亚群及CD19+B淋巴细胞改变 SAP组、MSAP组CD3+T淋巴细胞比率、CD4+T淋巴细胞比率、CD19+B淋巴细胞比率均较对照组、MAP组下降(P<0.05)，SAP组较MSAP组下降(P<0.05)，MAP组与对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)；AP各组CD4+/CD8+比值均较对照组下降(P<0.05)，SAP组较MSAP、MAP组下降(P<0.05)，MSAP组较MAP组下降(P<0.05)。AP各组CD8+T淋巴细胞比率与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 外周血淋巴细胞亚群Tab.1 Lymphocyte subsets in peripheral

2.2外周血淋巴细胞自噬、凋亡 SAP患者淋巴细胞自噬率较MSAP、MAP组及对照组升高(P<0.05)，MSAP组较MAP组、对照组升高(P<0.05)，MAP组与对照组差异无统计学意义(P>0.05，表2、图1)。 以二维散点图记录淋巴细胞凋亡情况，结果显示对照组外周血中有少量淋巴细胞凋亡，MAP组外周血淋巴细胞凋亡与对照组差异无统计学意义(P>0.05)，SAP组外周血淋巴细胞凋亡较对照组及MAP、MSAP组升高(P<0.05)，MSAP组较MAP及对照组升高(P<0.05，表2、图2)。

表2 外周血淋巴细胞自噬率及凋亡率Tab.2 Lymphocytes autophagy and apoptosis rates in peripheral blood

图1 外周血淋巴细胞自噬情况Fig.1 Autophagy of lymphocytes in peripheral blood

图2 外周血淋巴细胞凋亡情况Fig.2 Apoptosis of lymphocytes in peripheral blood

2.3血清LC3、Caspase-3水平 SAP患者入院24 h血清LC3水平较MSAP、MAP组及对照组升高(P<0.05)，MSAP组较MAP组及对照组升高(P<0.05)，MAP组与照组差异无统计学意义(P>0.05)。血清Caspase-3水平较MSAP、MAP及对照组升高(P<0.05)，MSAP较MAP及对照组升高(P<0.05)，MAP组与对照组差异无统计学意义(P>0.05，图3)。

图3 血清LC3、Caspase-3水平Fig.3 Serum of LC3 and Caspase-3 levelsNote:*.P<0.05 vs control group;#.P<0.05 vs MAP group;△.P<0.05 vs MSAP group.

2.4外周血LC3、Caspase-3水平与淋巴细胞自噬率、凋亡率及CD4+T细胞比率、CD4+/CD8+比值的相关性 Pearson相关性分析结果显示，MSAP、SAP患者入院24 h外周血 LC3水平与淋巴细胞自噬率呈正相关(P<0.05)。LC3水平与CD4+T细胞比率呈负相关(P<0.05)，LC3水平与CD4+/CD8+比值呈负相关(P<0.05)，随血清LC3水平升高，淋巴细胞自噬率升高，而CD4+T细胞比率、CD4+/CD8+比值降低(图4)。MSAP、SAP患者入院24 h外周血Caspase-3水平与淋巴细胞凋亡率呈正相关(P<0.05)。Caspase-3水平与CD4+T细胞比率呈负相关(P<0.05)；Caspase-3水平与CD4+/CD8+比值呈负相关(P<0.05)。随着血清Caspase-3水平升高，淋巴细胞凋亡率升高，而CD4+T细胞比率、CD4+/CD8+比值降低(图5)。

图4 外周血LC3水平与淋巴细胞自噬率以及CD4+ T细胞比率、CD4+/CD8+比值的相关性Fig.4 Correlation between level of LC3 with autophagy rate of lymphocyte,CD4+ T cell ratio and CD4+/CD8+ ratio in peripheral blood

图5 外周血Caspase-3水平与淋巴细胞凋亡率、CD4+ T细胞比率、CD4+/CD8+比值的相关性Fig.5 Correlation between level of Caspase-3 with apoptosis rate of lymphocytes,CD4+ T cell ratio and CD4+/CD8+ ratio in peripheral blood

2.5外周血LC3、Caspase-3水平与CD19+B淋巴细胞比率的相关性 Pearson相关性分析结果显示，MSAP、SAP患者入院24 h外周血LC3、Caspase-3水平与CD19+B淋巴细胞比率呈负相关(P<0.05)，随血清LC3、Caspase-3水平升高，CD19+B淋巴细胞比率降低(图6)。

图6 外周血LC3、Caspase-3水平与CD19+ B淋巴细胞比率的相关性Fig.6 Correlation between levels of LC3 and Caspase-3 with CD19+ B lymphocytes ratio in periphe-ral blood

3 讨论

淋巴细胞是免疫系统中最重要的细胞群之一，维持机体正常免疫功能。研究发现淋巴细胞参与AP炎症反应，通过对其亚群的检测可以发现淋巴细胞亚群的改变与AP病情发展密切相关[11-13]。研究表明，AP患者外周血T淋巴细胞亚群明显减少，主要是CD3+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞的减少及CD4+/CD8+比值下降，上述变化与机体免疫抑制和继发感染密切相关[14,15]。CD19代表外周血总B淋巴细胞，在机体体液免疫调节功能中发挥重要作用，检测其表达有助于评估AP患者机体B淋巴细胞活性情况及机体体液免疫功能[16]。Ueda等[17]研究发现，SAP患者早期存在CD19+B淋巴细胞减少，说明SAP患者体液免疫亦受到损害。本研究显示，SAP组、MSAP组CD3+T淋巴细胞比率、CD4+T淋巴细胞比率、CD19+B淋巴细胞比率均较对照组、MAP组下降，SAP组较MSAP组下降；MAP组较对照组仅轻度下降；AP各组CD4+/CD8+比值均较对照组下降，SAP组较MSAP、MAP组下降，MSAP组较MAP组下降。提示MSAP患者机体存在免疫功能受损，随着病情进一步发展为SAP时，各淋巴细胞亚群比率及CD4+/CD8+比值进一步降低，细胞免疫及体液免疫功能损害进一步加重，与既往研究结论一致。

目前，AP患者外周血淋巴细胞亚群减少的发生机制尚未明确，淋巴细胞自噬、凋亡异常可能是导致其改变的重要原因之一[4,5]。研究认为，低水平自噬对维持淋巴细胞稳态具有重要作用，但在炎症及各种氧化应激状态时，过度自噬可诱导细胞凋亡[18，19]。另有研究报道SAP患者体内淋巴细胞大量凋亡，淋巴细胞亚群减少，机体出现免疫功能障碍，提高感染等并发症发生率，提示淋巴细胞凋亡与AP患者免疫抑制密切相关[9,20]。因此，正常自噬、凋亡对维持机体淋巴细胞数目在正常水平发挥重要作用。本研究检测AP患者及对照组血清LC3、Caspase-3水平、淋巴细胞自噬率及凋亡率，结果显示SAP患者血清LC3、Caspase-3水平、淋巴细胞自噬率及凋亡率较对照组、MAP组及MSAP组升高，MSAP组较MAP及对照组升高，而MAP组较对照组仅轻度升高，与对照组差异无统计学意义。提示在MSAP及SAP中存在LC3、Caspase-3水平异常升高，自噬率、凋亡率提高，淋巴细胞过度自噬及凋亡导致机体淋巴细胞数量明显减少，免疫功能受损，加快AP进展。

为进一步探讨淋巴细胞亚群改变与自噬、凋亡的关系，课题组将LC3、Caspase-3表达水平与淋巴细胞自噬率、凋亡率及CD4+T淋巴细胞比率、CD4+/CD8+比值、CD19+B淋巴细胞比率分别进行了相关性分析，结果显示，MSAP及SAP组LC3、Caspase-3水平与CD4+T淋巴细胞比率、CD4+/CD8+比值、CD19+B淋巴细胞比率均呈显著负相关，随LC3、Caspase-3水平升高，CD4+T淋巴细胞比率、CD4+/CD8+比值、CD19+B淋巴细胞比率下降。提示MSAP、SAP患者LC3、Caspase-3表达上升，而作为自噬及凋亡过程中最重要的调控蛋白，二者表达升高可导致自噬、凋亡过度激活，淋巴细胞数量减少，CD4+/CD8+比值、CD19+B淋巴细胞比率下降，机体免疫功能受损，病情加重。因此，抑制LC3、Caspase-3表达，从而抑制AP患者异常激活的自噬与凋亡可改善AP患者机体免疫功能，缓解患者病情。