探究miR-27与IL-10在晚期乳腺癌患者治疗前后的表达及临床意义①

吕庆福 过兆基 姜 敏

(苏州大学附属第一医院普外科,苏州 215006)

乳腺癌是女性最为常见的恶性肿瘤，全球癌症统计显示，2018年全球乳腺癌新增女性患者208.9万例，占所有女性癌症发病率的24.22%，而因乳腺癌死亡的女性患者高达62.67万例，占所有女性癌症死亡率的15.03%，如此高的发病率与死亡率给女性的生活质量与健康安全带来极大威胁[1]。目前临床上关于乳腺癌的治疗方案主要以手术治疗为主，但多数患者入院就诊时病程已达中晚期，错过了最佳治疗时机，临床上需采用化疗等方案进行治疗[2]。虽然化疗在改善乳腺癌患者生存与预后方面具有显著效果，但临床上关于晚期乳腺癌患者化疗后疗效评估的指标较少[3]。目前临床上主要通过影像学检测评估患者病情，但影像学检测对患者身体具有一定损害，相对于影像学检测，血清学检测具有费用低、时间短的特点[4]。因此，寻找出一种特异度与灵敏度较高的血清学指标对患者预后的预测十分关键。

近年来miRNA受到众多学者关注，其作为一类长度约为22 nt的非编码短链RNA，主要作用是通过对其下游靶基因mRNA 3′端非翻译区(untranslated regions，UTR)进行完全或不完全结合互补从而影响mRNA的稳定性或抑制其翻译，起到调控蛋白表达的作用[5-7]。研究显示，miRNA可调节人体中大部分的基因转录，在细胞生长、增殖、凋亡过程中具有重要作用[8]。有研究报道miR-27在乳腺癌中存在差异表达，有望成为乳腺癌的潜在诊断指标[9]。IL-10作为一种抑炎因子，其抑制作用在多种细胞中皆有所效果，此类因子的主要功能是抑制由特异与非特异免疫反应引起的组织损伤，增强患者免疫系统功能，具有“清道夫”的作用[10]。然而关于miR-27与IL-10能否作为晚期乳腺癌患者疗效的预测指标尚不明确。本研究探究了miR-27与IL-10在晚期乳腺癌患者治疗前后的表达及临床意义，为临床疗效观察提供参考。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1患者临床资料 收集2014年5月～2015年9月于本院治疗的晚期乳腺癌患者60例作为本次观察组，另收集同期健康志愿者50例作为对照组，其中对照组志愿者年龄(50.2±7.2)岁，观察组患者年龄(49.0±6.2)岁，临床分期Ⅲ期18例，Ⅳ期42例；浸润性导管癌32例，浸润性小叶癌14例，髓样癌9例，硬癌5例；TNM分期Ⅱb期40例，Ⅲa期12例，Ⅲb期8例；激素受体ER+/PR+33例，ER-/PR-27例，两组患者年龄无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：所有患者均通过病理及免疫组化检测确诊为乳腺癌；患者病灶可被测量；患者预计生存时间≥3个月；患者临床资料齐全，配合治疗与随访。排除标准：男性患者；患者存在先天性心、肾、肝、肺功能缺陷；患者存在免疫性缺陷疾病，不配合治疗；患者治疗前存在严重感染、创伤；患者合并其他恶性肿瘤。

1.1.2药物与试剂 多西他赛(江苏恒瑞医药股份有限公司)；吡柔比星(深圳万乐药业有限公司)；环磷酰胺(baxter oncology GmbH，进口药品注册证号：H20160467)；地塞米松(上海上药信谊药厂有限公司)；托烷司琼(江苏恒瑞医药股份有限公司)，奥美拉唑(常州四药制药有限公司)；EasyPure miRNA Kit、TransScript Green miRNA Two-Step qRT-PCR SuperMix(北京TransGen Biotech公司，ER601-01，AQ202-01)；IL-10 ELISA试剂盒(中国上海Beyotime Biotechnology公司，PI528)。

1.2方法

1.2.1治疗方案 患者治疗前3 d口服地塞米松药物5 mg，1次/d，化疗前30 min采用托烷司琼与奥美拉唑治疗，托烷司琼5 mg，1次/d，奥美拉唑20 mg，2次/d，口服，具体化疗方案如下：第1天，静脉注射多西他赛75 mg/m2，环磷酰胺600 mg/m2，吡柔比星40 mg/m2，3周为1个疗程，治疗2个疗程后评估患者临床疗效。

1.2.2样本收集 收集观察组患者治疗前后及健康志愿者空腹外周血静脉5 ml，静置30 min后，以3 000 r/min 离心10 min，收集上清，即刻进行后续实验。

1.2.3指标检测

1.2.3.1qRT-PCR检测miR-27 试剂盒提取总RNA，紫外分光光度仪与琼脂糖凝胶电泳检测总RNA纯度、浓度与完整性。按照试剂盒说明书将总RNA反转录为cDNA，PCR扩增，PCR反应体系：cDNA 1 μl，上下游引物各0.4 μl，2×TransTaq®Tip Green qPCR SuperMix 10 μl，Passive Reference Dye(50×)0.4 μl，ddH2O补全体系至20 μl。PCR反应条件：94℃预变性30 s，94℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，共进行40个循环。每个样品设3个复孔，实验重复3次。本研究以U6为内参，使用2-ΔΔCt对本次数据进行分析。miR-27 F:5′-TTCACAGTGGCTAAGTTCCGC-3′，R:5′-AGGGCTTAGCTGCTTGTGA-GCA-3′，U6 F:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.2.3.2EILSA检测IL-10 将收集到的血清分别加入50 μl不同浓度的标准品溶液并置于空白微孔；空白对照孔加入50 μl蒸馏水和50 μl抗体；其余微孔中先加入样品40 μl，再加入生物素标记的抗体10 μl。封板后37℃温育30 min，洗板时每孔洗涤液保证满而不溢静置30 s弃去洗涤液，拍干，重复5次，各孔加入50 μl酶标溶液，再次封板，37℃温育60 min，洗板共5次，最后1次使用吸水纸彻底拍干，加入辣根过氧化物酶标记(100 μl/孔)后封板，37℃下避光温育15 min，以100 μl/孔加入显色底物TMB，室温避光孵育20 min，最后加入终止液(50 μl/孔)，15 min内酶标仪检测，测定450 nm处最大吸收波长。实验设置3组复孔，重复3次。

1.2.4患者生存随访 对患者进行为期3年的生存随访，随访方式采用电话与门诊复查的方式进行，随访时间为每3个月1次。

1.2.5疗效评估标准 患者进行为期2个疗程的治疗后行临床疗效评估，根据MRI与CT结果计算患者肿瘤大小变化，根据RECIST实体瘤缓解评估标准进行疗效分级：完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)、进展(PD)[11]。

1.2.6观察指标 主要观察指标：比较观察组与对照组miR-27与IL-10表达情况，观察患者治疗前后miR-27与IL-10表达变化，根据患者生存情况绘制生存曲线，根据治疗前miR-27与IL-10表达中位值分为高表达组和低表达组，观察miR-27与IL-10高、低表达在患者生存中的价值。次要观察指标：观察患者临床疗效，根据临床疗效将患者分为疗效优秀组与疗效较差组比较两组患者治疗前miR-27与IL-10表达，绘制受试者工作(ROC)曲线，分析治疗前miR-27与IL-10的表达在疗效中的预测价值。

2 结果

2.1miR-27与IL-10在两组中表达 结果表明，对照组受试者血清中miR-27表达(1.027±0.08)明显低于观察组患者(1.475±0.178)(t≤16.379，P<0.001)，IL-10表达(12.432±1.978)pg/ml明显高于观察组患者(7.716±1.205)pg/ml(t≤15.356，P<0.001)。见图1。

图1 miR-27与IL-10在对照组与观察组中的表达Fig.1 Expressions of miR-27 and IL-10 in control group and observation groupNote:***.P<0.001.

2.2观察组患者治疗后血清中miR-27与IL-10表达变化 观察组患者治疗后血清中miR-27表达(1.241±0.104)明显低于治疗前(1.475±0.178)(t=9.147，P<0.001)，IL-10表达(10.702±1.566)pg/ml明显高于治疗前(7.716±1.205)pg/ml(t=11.561，P<0.001)，见图2。

图2 观察组患者治疗前后血清中miR-27与IL-10表达比较Fig.2 Comparison of expressions of miR-27 and IL-10 in serum of patients in observation group before and after treatmentNote:***.P<0.001.

2.3治疗前miR-27与IL-10表达在临床疗效中的预测价值 观察组患者通过治疗后，共有CR患者17例，PR患者21例，SD患者15例，PD患者7例，根据患者临床疗效将CR+PR患者分为疗效优秀组(EC group)(n=38)，SD+PD患者分为疗效较差组(PC group)(n=22)，比较两组患者治疗前血清中miR-27与IL-10表达发现，疗效优秀组患者血清中miR-27表达(1.425±0.188)明显低于疗效较差组(1.562±0.120)患者(t≤3.082，P<0.003)，IL-10表达(8.001±1.171)明显高于疗效较差组(7.255±1.125)pg/ml(t≤2.509，P<0.015)。ROC曲线绘制发现miR-27与IL-10曲线下面积分别为0.719与0.685，存在预测价值，见表1、图3。

图3 治疗前miR-27与IL-10表达在临床疗效中的预测价值Fig.3 Predictive values of miR-27 and IL-10 expressions in clinical efficacy before treatmentNote:*.P<0.05，**.P<0.01.

表1 ROC参数(%)Tab.1 ROC parameters(%)

2.4miR-27与IL-10在患者生存中的价值 通过对60例患者进行为期3年的随访，存活患者为30例，3年存活率为50%，根据miR-27与IL-10中位值将其分为高、低表达组，比较miR-27与IL-10高、低表达组患者生存情况发现，miR-27低表达组患者3年存活率明显高于高表达组患者，而IL-10低表达患者3年生存率明显低于高表达组患者(P<0.05)，见图4。

图4 miR-27与IL-10高、低表达与患者3年生存情况的关系Fig.4 Relationship between high and low expressions of miR-27 and IL-10 and survival of patients in 3 yearsNote:A.Total survival rate of patients in 3 years;B.Survival rate of patients in miR-27 high and low expression groups in 3 years;C.Survival rate of patients of IL-10 in high and low expression group in 3 years.

3 讨论

乳腺癌作为女性常见恶性肿瘤，在2012年全球新增患者约168万例，而死亡患者超过52万人，并且有向年轻化发展的趋势，严重威胁人们的生命健康与生活质量[12]。临床上关于乳腺癌的治疗方案主要以手术为主，但乳腺癌发病初期较为隐匿，入院治疗基本已进入中晚期，错过了最佳治疗时机，因此化疗就成为这类患者治疗的首选方案[13]。虽然患者通过化疗后可显著改善病情，但临床上关于乳腺癌化疗后的疗效预测指标较少[14]。若能提前通过检测相关指标来判定患者预后情况，势必可以更好地改善患者病情。

miRNA是一类长约19-22 nt的非编码短链RNA，具有高度保守性，可通过完全或不完全互补配对的方式与靶基因3′-UTRs结合，参与靶基因调控，研究显示，miRNA与肿瘤及心血管疾病等密切相关[15,16]。miR-27是miR家族中的重要成员，也称为miR-27a，位于染色体19p13.12，Tang等[17]研究发现，miR-27可作为乳腺癌进展和患者生存的预后标志物。IL-10是一类多功能的细胞因子，对细胞的生长分化起调节作用，并参与炎症反应及免疫反应[18]。Ahmad等[19]研究发现IL-10与浸润性乳腺癌患者的良好预后相关，但miR-27与IL-10能否作为晚期乳腺癌患者化疗疗效的潜在预测指标目前尚未明确。本研究通过探究miR-27与IL-10在晚期乳腺癌患者中的表达及疗效预测价值，为临床医生提供潜在观察指标。

本研究首先检测了患者血清中miR-27与IL-10的表达。组织样本收集对患者存在入侵性伤害，而本研究通过检测患者血清中目的基因表达，对患者损伤较小。检测结果发现观察组患者血清中miR-27表达明显高于对照组，而IL-10的表达明显低于对照组，提示miR-27与IL-10在晚期乳腺癌患者中存在差异表达，与既往的研究结果相符[20，21]。进一步检测了患者化疗后miR-27与IL-10的表达发现，患者治疗后miR-27表达明显降低，IL-10的表达明显升高，提示miR-27与IL-10有望成为乳腺癌化疗后的潜在观察指标。推测其机制可能是由于化疗提升了miR-27表达，从而靶向调节IL-10表达，但具体原因尚不明确[22]。

课题组根据患者治疗后的临床疗效分组进一步观察疗效优秀组患者与疗效较差组患者治疗前血清中miR-27及IL-10表达发现，疗效优秀组患者治疗前miR-27表达明显低于疗效较差组，而IL-10与其相反，说明miR-27和IL-10可能成为乳腺癌患者化疗后疗效的观察指标。ROC曲线结果显示，miR-27与IL-10曲线下面积分别为0.719、0.685，提示化疗前通过观察miR-27与IL-10的表达对疗效预测存在一定价值。随访结果显示患者3年生存率为50%，与国内文献结果相符[23]。根据患者治疗后两指标中位值将其分为高表达组和低表达组观察各组生存情况发现，miR-27低表达组与IL-10高表达组患者生存率明显高于其对应组，提示通过观察化疗后乳腺癌患者miR-27与IL-10的表达水平对评估患者生存情况存在一定价值。

本研究还存在一定的局限性，首先，作为临床研究，关于化疗后miR-27与IL-10表达发生变化的机制尚不清楚；其次，miR-27与IL-10虽然对化疗后临床疗效预测价值具有较高的敏感度，但其特异度较低，是否能通过联合肿瘤标志物提升特异度目前尚不明确；最后，由于样本及时间原因，并未进行5年甚至更长时间的随访，课题组将在今后的研究中开展基础实验，联合更多临床指标，延长随访时间，补充本次研究结果。

综上所述，晚期乳腺癌患者治疗前后的miR-27与IL-10可作为晚期乳腺癌患临床疗效与生存的观察指标。