氧化苦参碱调节CIA小鼠滤泡辅助性T细胞的研究①

曹 干 王宁萍 崔振华 王佩佩 杨勇娅 张艳丽

(宁夏医科大学基础医学院病原生物学与免疫学系，银川 750004)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是慢性、进行性、侵蚀性自身免疫性疾病，以关节滑膜炎症为特征，其发病机制通常认为与CD4+T淋巴细胞分化异常有关。滤泡辅助性T(T follicular helper，Tfh)细胞是可促进淋巴滤泡生发中心形成、辅助B细胞活化、增殖、分化并产生高亲和力抗体的CD4+T细胞，研究提示Tfh细胞在RA的炎症形成、关节软骨及骨质破坏、骨侵蚀中具有重要作用[1，2]。RA治疗多使用非甾体类抗炎药和糖皮质激素，但仅能缓解症状且副作用较多。生物制剂治疗逐渐被关注，已取得一定疗效，如英夫利昔单抗(Infliximab)，但价格昂贵。本课题组前期研究发现从宁夏道地药材苦豆子中提取的氧化苦参碱(oxymatrine，OMT)在小鼠体内显示了较好的抗炎作用，可通过调节Treg/Th17细胞平衡起抗RA作用，但作用机制尚不明确[3，4]。本实验通过构建DBA/1J小鼠胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis，CIA)模型，明确OMT治疗效果，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 50只雄性SPF级DBA/1J小鼠购自卡文斯实验动物有限公司(No.201708981)，6～7周龄，体质量18～22 g。饲养于我院动物室洁净柜，室温20～25℃，相对湿度55%，自由饮食。DBA/1J小鼠随机分为6组：正常组、模型组、地塞米松组、OMT高、中、低剂量组，每组7只。实验中意外死亡的小鼠或造模未成功的小鼠用同批次其余8只小鼠做相应补充。

1.1.2药物 OMT(批号：20161028)购自宁夏紫荆花药业股份有限公司，纯度99.18%；地塞米松注射液[5 mg/(2 ml·支)]购自山东辰欣药业集团。根据文献[5]确定本实验OMT高剂量组(OMT-H)OMT浓度为180.0 mg/(kg·d)，中剂量组(OMT-M)为90.0 mg/(kg·d)，低剂量组(OMT-L)为45.0 mg/(kg·d)。用生理盐水溶解OMT并过滤，4℃保存待用。

1.1.3试剂 牛源性Ⅱ型胶原购自Chondrex公司；完全及不完全弗氏佐剂购自Sigma公司；Percpcy5.5标记的Anti-mouse-CD4、FITC标记的Anti-mouse-CXCR5、PE标记的Anti-mouse-ICOS购自BD公司；小鼠IL-21 ELISA试剂盒购自欣博盛公司；小鼠血清Ⅱ型胶原抗体(CⅡ-Ab)ELISA试剂盒购自上海宝曼生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1建模 将2.0 mg/ml的牛源性Ⅱ型胶原和等体积完全弗氏佐剂混合并完全乳化后，皮下多点注射于各组小鼠背部近尾1～2 cm处，0.1 ml/只，正常组注射等体积生理盐水，21 d后同法加强免疫。造模后第15天，阳性药物组腹腔注射地塞米松，2.8 mg/kg，1次/d，持续1周，1周后以1.4 mg/kg 剂量维持；OMT高、中、低剂量组依照方案分别行腹腔注射；正常组及模型组腹腔注射等体积生理盐水。治疗30 d后于第45天依据宁夏医科大学伦理委员会相关规定处死全部小鼠。

1.2.2观测CIA小鼠关节肿胀度 每隔3 d由专人使用游标卡尺测量并记录各组小鼠右爪和右踝关节厚度，连续测量至第45天，计算CIA小鼠关节肿胀程度(mm2)=右爪肿胀(mm)×右踝肿胀(mm)。

1.2.3评估CIA小鼠关节炎指数(arthritis index，AI) 小鼠关节肿胀程度参考文献[6]进行分级，每只足爪关节的评分最高为4分：0分为正常，无红肿迹象；1分为1个或多个小趾关节轻微红肿；2分为足跖和趾关节出现肿胀；3分为小鼠踝关节及以下足爪出现红肿；4分为小鼠整个足爪以及踝关节肿胀，最高分数为16分。

1.2.4流式细胞术检测小鼠脾Tfh细胞比例 各组小鼠脱颈处死后无菌摘取脾脏并采用淋巴细胞分离液制备单个核细胞悬液，细胞浓度为2×106个/50 μl。避光加入Percpcy5.5标记的Anti-mouse-CD4、FITC标记的Anti-mouse-CXCR5、PE标记的Anti-mouse-ICOS抗体，同时设空白细胞管和单抗体标记管，锡纸包裹置4℃冰箱孵育30 min。洗涤2次后用300 μl PBS混匀重悬细胞。300目滤膜过滤后，流式细胞术检测，Flowjo7.6.5软件分析数据。

1.2.5HE染色法观察CIA小鼠关节组织情况 取小鼠右后肢关节制作蜡块，切成4 μm薄片行HE染色，显微镜下观察关节滑膜组织形态结构。

1.2.6ELISA法检测小鼠血清IL-21和CⅡ-Ab含量 小鼠摘眼球取血，离心取血清，按ELISA试剂盒内说明书检测。

2 结果

2.1OMT缓解CIA小鼠的关节炎症状 治疗21 d后OMT高、中剂量组小鼠关节红肿情况缓解，细胞排列较规则且增生情况减轻、淋巴细胞浸润减少、滑膜层数变薄，OMT低剂量组未见明显改善，地塞米松组有少量淋巴细胞浸润，与正常组相比差异无统计学意义。见图1。

图1 CIA小鼠的关节炎表现(×100)Fig.1 Arthritis in CIA mice(×100)Note:1.Normal;2.Model;3.DXM;4.OMT-H;5.OMT-M;6.OMT-L.

2.2OMT缓解CIA小鼠关节肿胀度并降低AI 地塞米松组、OMT高剂量组小鼠在首次免疫后第32天关节肿胀明显缓解，治疗3周后，地塞米松组、OMT高、中、低剂量组小鼠关节肿胀明显缓解。模型组小鼠AI随时间延长逐渐升高，第25天时达到高峰，后随给药时间延长下降，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05，图2)。

图2 CIA小鼠的关节肿胀度及关节炎指数评分Fig.2 Joint swelling degree and arthritis index score of CIA miceNote:1.Normal;2.Model;3.DXM;4.OMT-H;5.OMT-M;6.OMT-L.*.P<0.05 vs Normal group；#.P<0.05 vs Model group.

2.3OMT降低CIA小鼠脾Tfh细胞比例 流式细胞术检测小鼠脾CD4+CXCR5+ICOS+Tfh细胞百分比结果显示，与正常组相比，模型组CD4+ICOS+CXCR5+Tfh细胞百分比显著升高(P<0.01)，地塞米松组、OMT高、中剂量组CD4+CXCR5+ICOS+Tfh细胞百分比显著下降(P<0.01，图3)。

图3 流式细胞术检测脾CD4+CXCR5+ICOS+ Tfh细胞百分比Fig.3 Flow cytometry was used to detect percentage of spleen CD4+CXCR5+ICOS+ Tfh cells

2.4OMT抑制CIA小鼠血清IL-21、CⅡ-Ab表达 与正常组相比模型组CIA小鼠血清IL-21和CⅡ-Ab表达显著升高(P<0.01)，OMT治疗30 d后，地塞米松组、OMT高、中剂量组小鼠血清IL-21和CⅡ-Ab水平降低(P<0.05)，且地塞米松组下降幅度大于OMT高剂量组，见图4。

图4 ELISA检测CIA小鼠血清IL-21和CⅡ-Ab表达Fig.4 ELISA to detect serum IL-21 and CⅡ-Ab expressions in CIA miceNote:1.Normal;2.Model;3.DXM;4.OMT-H;5.OMT-M;6.OMT-L.*.P<0.05 vs Normal group；#.P<0.05 vs Model group.

3 讨论

Tfh细胞是位于次级淋巴组织(secondary lymphoid organs，SLOs)生发中心的可辅助B细胞产生抗体的CD4+T细胞，其表达的特征性膜表面分子主要包括：趋化性细胞因子受体(CXC chemokine receptor 5,CXCR5+)、诱导共刺激分子(inducible costimulatory molecule,ICOS)、程序性细胞死亡蛋白(programmed cell death protein 1,PD-1)、CD40L等，高表达锌指结构转录因子Bcl-6(B-cell lymphoma-6)，可分泌IL-21[7，8]。Tfh细胞通过表达CXCR5识别其配体CXCL13并结合引导Tfh细胞迁移至淋巴滤泡形成生发中心。ICOS可与主要表达于B细胞的ICOS配体结合，促进Tfh细胞分泌炎症细胞因子IL-21。IL-21通过与生发中心B细胞表面或Tfh细胞自身表达的IL-21受体结合，促进浆细胞分化产生大量抗体并诱导Tfh细胞表达CXCR5并迁移至生发中心，维持T-B细胞动态平衡[9]。Bcl-6是初始CD4+T细胞分化为Tfh细胞的必要条件，且可诱导CXCR5表达，缺乏Bcl-6则T细胞生发中心无法形成，亦不能分化为Tfh细胞，影响Th1、Th2、Th17细胞分化[10]。由于Tfh细胞对生发中心B细胞的多种生物学作用，决定其数量或功能的改变都将引起免疫应答紊乱，导致免疫系统疾病[11]。

RA的病因和发病机制尚不明确，但不同亚群的CD4+T细胞一直备受关注[12，13]。研究表明Tfh细胞在CD4+T细胞中的比例升高或其功能发生紊乱参与RA发生发展。Wang等[14]发现初发RA患者外周血存在高比例循环的CD4+CXCR5+、CD4+CXCR5+ICOS+和CD4+CXCR5+PD-1+Tfh细胞，且RA患者血清高水平IL-21与疾病活动度呈正相关。Ma等[15]证实RA患者与健康志愿者相比，其外周血循环CD4+CXCR5+ICOShighTfh细胞增多，并伴随抗环瓜氨酸多肽抗体(anti-CCP)水平升高。Jang等[16]构建IL-21受体缺陷的K/BxN小鼠RA模型，发现IL-21水平下降且Tfh细胞数量减少导致RA进展减缓。OMT是从宁夏道地中草药苦豆子中提取的单体碱，前期实验结果提示OMT可缓解CIA大鼠关节肿胀、降低关节炎指数并能调控Th17细胞数量，因此本团队主要研究OMT能否作用于Tfh细胞而干预RA发生发展。本实验通过建立CIA小鼠模型观察Tfh细胞在RA发生发展中的作用，结果表明CIA模型组小鼠脾CD4+CXCR5+ICOS+Tfh细胞比例增高、血清IL-21水平升高、产生大量CⅡ-Ab，高、中剂量OMT可抑制Tfh细胞过度增殖和活化，抑制IL-21的高水平分泌及大量抗体的产生，HE染色结果显示OMT缓解CIA小鼠关节组织的炎症病理变化，提示OMT可能对Tfh细胞具有调控作用从而治疗RA。但OMT是如何调控Tfh细胞表面膜分子表达和细胞因子分泌从而达到治疗RA的免疫学分子机制有待进一步研究。