利用滑石粉作为甜玉米花粉增量剂的贮藏技术分析及应用

龙誉铭 夏州藩 赵竑博

摘要：【目的】利用滑石粉作為增量剂稀释甜玉米花粉，对比离体花粉在不同稀释比例、不同温度和不同贮藏时间条件下的储藏效果，为提高玉米育种和制种产量及降低减产风险提供参考依据。【方法】以金卡HM608甜玉米的父本花粉为试验材料，用滑石粉作为玉米花粉的增量剂，共设3个（按质量分数）增量剂填充处理（10%、30%、100%），4个时间处理（1、3、5和7 d），5个温度处理（-5、5、10、15和25 ℃），以不添加增量剂的花粉作为对照，结合田间测定法及氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色法，探讨在不同增量剂比例、不同处理温度及处理时间下离体甜玉米花粉的TIC染色率和田间结实率。【结果】当处理温度为-5、5和10 ℃时，贮藏1 d的花粉田间结实率在82.26%以上;贮藏5 d后，无增量剂花粉的T TC染色率及田间结实率显著下降，平均为25.24%和13.68%;添加10%和30%增量剂的花粉，贮藏5 d仍然有61.22%以上的田间结实率;当增量剂比例在100%且贮藏为5 d时，田间平均结实率为7.19%，当处理温度为15和25 ℃时，田间结实率为0，反映出增量剂比例和温度过高均不利于花粉的保存，增量剂越多或持续时间越长对花粉活力伤害越大。不同增量剂填充处理的花粉活性及田间结实率均随着处理温度上升和贮藏时间延长而降低。【结论】保存温度在-5～10 ℃，添加10%和30%滑石粉作为甜玉米花粉增量剂能有效延长花粉生活力，该贮藏技术操作简单易行，对于指导授粉工作、减少制种风险、提高制种产量具有现实意义。

关键词： 甜玉米;花粉活力;滑石粉;增量剂;贮藏技术

中图分类号： S513                            文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）07-1669-08

Abstract：【Objective】Using talcum powder as increment agent to dilute sweet corn pollen，the storage effect of in vitro pollen under different dilution ratios，different temperatures and different storage times was compared，which provided reference for improving maize breeding and seed production yield and reducing the risk of reduction. 【Method】With Gold Card HM608 male parent of maize pollen as research materials，taking talcum powder as the increment agent of corn po-llen， set up three（by mass fraction）incremental doses of filling processing（10%， 30% and 100%），four duration of treatments（1， 3， 5 and 7 d）and five different processing temperatures（-5， 5， 10， 15 and 25 ℃）. The pollen without adding increment agent was set as the control. Field assay and 2，3，5-triphenyltetrazolium chloride （TTC） staining were both used to investigate the TTC staining rate and seed setting rate of sweet corn pollen in vitro at different proportional increment agents，treatment temperatures and treatment times. 【Result】When the storage temperature was -5， 5 and 10 ℃，the field seed setting rate of pollen stored for 1 d was above 82.26%. After 5 d of storage，the TTC staining rate and field setting rate of pollens without increment decreased significantly，averaging 25.24% and 13.68%. After adding 10% and 30% increment to pollen，the field setting rate was still over 61.22% after 5 d storage. When the proportion of increment agent was 100% and the storage time was 5 d， the average field setting rate was 7.19%;when the storage temperature was 15 and 25 ℃，the field setting rate was 0，reflecting that both the proportion of increment agent and the temperature were too high，and the more increment agent or the longer the duration，the greater the harm to pollen viability. Under different increment agent treatments， the pollen activity and field setting rate decreased with the increase of treatment temperature and storage time. 【Conclusion】According to the comprehensive analysis，the storage temperature of -5-10 ℃，and the addition of 10% or 30% talcum powder as sweet corn pollen increment agent can effectively prolong pollen viability. This storage technology is easy to operate，and has practical significance for guiding pollination，reducing seed production risk and increasing seed production yield.

Key words： sweet corn; pollen viability; talcum powder; incremental agent; storage technology

Foundation item： National Vegetable Industry Technology System Project of China（CARS-23-G-49）; International Science and Technology Cooperation and Innovation Platform Project of Higher Education of Guangdong（GJHZ1140）

0 引言

【研究意义】甜玉米花粉是甜玉米的雄性器官，包含甜玉米的所有基因类型，是甜玉米种质保存、交换及杂交育种的重要材料（张亚利等，2006;Lee et al.，2014）。近年来，甜玉米在南方地区制种面积不断扩大，由于高温高湿气候影响，许多甜玉米花粉的寿命非常短，在常温下只能维持几小时就糖化结块，丧失活力。滑石粉以其疏水抗黏、分散性好、柔软、耐高温等优良的理化特性，再加上价格低廉、容易购买的特点，已成为育种企业和农户首选的花粉填充材料，并被广泛应用于甜玉米授粉作业中。在实际生产中，当气温高于32～35 ℃、空气湿度达30%以上，会使玉米抽雄提前，雌穗吐丝延迟，造成雌雄不调（任转滩等，2008），还会使花粉发育不正常或败育，导致花粉数量减少、生活力减弱，甚至完全丧失受精能力（杨国虎，2005）。研究表明，玉米自交系在不同地区及气候环境影响下，父母本花粉和花丝变化敏感程度不同（郑飞等，2015），通常会造成花期不遇，在母本发育过迟的情况下，如能及时采集父本花粉并保存3～5 d，待母本吐丝后，避开高温及雨水的影响，选择相对适宜的时段及时人工授粉，可有效补救或挽回经济损失。因此，深入探讨滑石粉作为甜玉米花粉增量剂的保存技术对于减少制种风险、提高制种产量及完善甜玉米种质资源保存方法具有重要意义。【前人研究進展】利用滑石粉作为花粉的增量剂已有文献报道。20世纪80年代，我国赠送日本“禾华松”马尾松树苗时，就用滑石粉作为增量剂稀释马尾松父本花粉（宋志强和朱勇，2007）;Cristián等（2008）利用滑石粉稀释核桃花粉，再通过人工授粉的方法，研究核桃花粉过量或缺乏引起的核桃花败育症状，探讨核桃花败育与核桃花梗发育的关系。此外，为延长玉米花粉生活力，前人对玉米花粉的保存方法也进行了相关研究。侯有良等（2001）研究表明，3个玉米自交系的花粉在常温下避光保存26 h后，只有1.2%～3.4%的田间结实率。张红梅等（2005）研究离体玉米花粉在不同温度条件下的生活力，结果显示，离体玉米花粉生活力保持在90%以上的储存条件是：24 ℃保存8 h，4 ℃保存32 h，-20 ℃保存56 h。亓文俭等（2009）研究发现，不同玉米自交系的花粉其生命活性不同，在田间自然过夜条件下（22～30 ℃），花粉粒的寿命在24～48 h。王霞等（2013）以不同类型玉米自交系为材料，田间采集花粉并在室内不同温度条件下保存一定时间，然后进行田间授粉，结果发现，在4 ℃条件下，贮藏5 d的花粉平均田间结实率为30%。宋方威等（2014）研究发现，玉米花粉在25 ℃室温条件下，8 h后基本丧失活力。以上研究结果揭示了温度和贮藏时间是影响玉米花粉生活力的重要因素，离体玉米花粉贮藏3～5 d后田间结实率已很低，不适合应用于实际生产。【本研究切入点】前人研究结果证实低温条件可显著延长玉米花粉的生活力，可使玉米花粉的寿命从几小时延长至几年，并能保持其品种的遗传稳定性（王艳哲等，2008），但以往研究主要侧重纯花粉低温贮藏技术或田间自然条件下花粉生活力的分析探索，而利用滑石粉作为甜玉米花粉增量剂的低温贮藏技术却鲜见报道，且以往研究成果只停留在实验室层面，在实际生产中并不适用，有些研究成果虽实用，但其对技术及设备的要求过高，很多生产企业难以实施。【拟解决的关键问题】以金卡HM608父本花粉为试验材料，在室内常温和低温条件下利用滑石粉作为增量剂稀释甜玉米花粉，对比离体花粉在不同稀释比例、不同温度和不同贮藏时间条件下的储藏效果，采取氯化三苯基四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）染色法和田间授粉法，测定TTC染色率和田间结实率，综合分析不同条件对甜玉米花粉活力和结实率的影响，以期获取简单易行、操作方便的花粉保存方法，为提高玉米育种和制种产量及降低减产风险提供参考依据。

1 材料与方法

1. 1 试验地概况

试验于2018年8—12月在广东省韶关市仁化县玉米制种基地进行，试验地位于东经113°28′、北纬251°13′，海拔高度100 m，属亚热带季风气候，冬春冷、夏秋热，年均气温19.6 ℃;4—9月降水量占全年降水量的70%，年平均降水量1648.3 mm;无霜期297 d。

1. 2 试验材料

玉米花粉来自广西金卡农业科技有限公司提供的金卡HM608甜玉米品种，取自大田生长盛花期的父本花粉。滑石粉为普通医用级滑石粉。

主要仪器设备：304不锈钢60目标准分样筛、超净工作台，冰箱，冷冻干燥机（上海乔跃，FD-1B-80），5 mL连盖圆底离心管，光学显微镜，载玻片，培养皿和电子分析天平。

1. 3 试验方法

1. 3. 1 试验设计 选择地势平整，前茬一致，肥力中上，排灌方便，四周无荫蔽的田块。种植密度为 45000株/ha，按长600 cm、宽150 cm（包括排灌沟）的标准进行双行定植，株距30 cm、行距60 cm，每畦种植40株，母本种植9个重复，合计360株，保苗320株。为方便试验，父本按照温度及时间处理划分4个小区种植，每期播种50株，合计200株。根据金卡HM608父母本错期特点（表1），母本8月1日播种，父本播种日期分别是8月1日、8月3日、8月5日和8月8日，做好标记，进入玉米雄穗盛花期后采粉处理。处理后首先测定花粉TTC染色率，同时进行田间人工授粉。田间授粉时间选择上午10：00以后，所用雌穗均处于吐丝后的第3和4 d，正值花丝生活力旺盛阶段，各处理雌穗的发育进程基本相同。为保证授粉的均匀一致，授粉前先剪短母本花丝，只留2～3 cm。每处理授粉4株，以当天采粉后立即授粉且不添加增量剂的花粉作为对照，授粉后用羊皮纸袋套好，大头针固定并做标记。待玉米成熟后，11月12日调查果穗结实情况，以结实率反映玉米花粉活力。结实率（%）=（各处理单穗结实粒数/对照平均单穗结实粒数）×100 。

1. 3. 2 花粉的取粉方法 在盛花期选择晴天，取粉的时间一般从上午10：00开始（大雾天气可选择11：00以后）。为方便取粉，先把靠近玉米雄穗的2片叶子剪掉，左手拿住取粉袋，右手把玉米雄穗倾斜置于采粉袋的喇叭口内，轻轻摇动，花粉即落入袋内。

1. 3. 3 筛粉及混合增量剂方法 所采的花粉里混有大量的花药，花药含水量较高，如不及时处理，花粉就会受潮黏合影响试验结果，因此花粉和增量剂（滑石粉）混合最好在取粉后90 min内完成。具体方法：筛粉前，在干燥平坦的地方铺一张质硬干净的白纸，把采集的花粉倒入60目标准分样筛里，来回摇动筛子，使花粉均匀地筛洒在纸上。然后把花粉与预定比例的增量剂（滑石粉）混合后重复过筛3次，使花粉增量剂与花粉搅拌均匀，将混合好的花粉均匀分散地平铺在纸上，放置在干燥通风的地方待用，尽量不要堆放。

1. 3. 4 花粉贮藏方法 将通过以上方法处理后的花粉，按10%、30%、100%的滑石粉填充剂比例进行稀释，以不添加增量剂的花粉作为对照。每个稀释比例5个重复，分别置于5 mL圆底离心管中，盖上离心管盖，再用保鲜膜密封。设置-5、5、10、15和25 ℃共5个温度梯度，使用冰箱设置-5和5 ℃贮藏，使用冷冻干燥机设置10、15和25 ℃贮藏，贮藏时间分别为1、3、5和7 d。

1. 3. 5 花粉活力室内测定方法 在离体花粉进行相关处理后，采取TTC法测定TTC染色率。具体方法：用0.5%氯化三苯基四氯唑溶液与适量花粉均匀混合做成切片，放在37 ℃的烘箱中，30 min后放置于光学显微镜下观察，目镜放大倍数为10×，物镜放大倍数为10×，凡被染为红色的为强活力花粉;淡红色的次之;无色则为无活力花粉（高俊凤，2000）。每个处理观察2张玻片，每玻片取4个视野，即每个处理共观察8个视野，要求每个视野花粉粒数≥20，统计花粉的平均染色率（以染色率代表花粉活力）。染色率（%）=（每個视野花粉染色粒数/每个视野花粉粒总数）×100。

1. 4 统计分析

利用 Excel 2010和 SPSS 18.0对相关数据进行非参数检验及方差分析，使用SPSS 18.0制图。

2 结果与分析

2. 1 不同增量剂条件下，处理温度及贮藏时间对TTC染色率及田间结实率的影响

由图1～图4可看出，不同温度处理胁迫下花粉活力丧失是一个连续变化的过程。处理温度为-5、5、10 ℃时，添加不同比例增量剂的花粉贮藏1 d，TTC染色率在85.17%以上，田间结实率在82.26%以上，均高于其余贮藏时间处理。处理温度为-5和5 ℃时，无增量剂（图1）及100%增量剂（图4）的花粉贮藏3 d，花粉TTC染色率平均为70.81%，田间结实率平均为60.25%，当处理温度超过10 ℃时，花粉活力随温度的升高、贮藏时间的延长迅速降低，当处理温度为15 ℃时，田间结实率迅速下降到15.00%以下。处理温度为-5～10 ℃、贮藏时间为1和3 d时，10%增量剂（图2）和30%增量剂（图3）的花粉活力及田间结实率较高，TTC染色率在93.37%以上，结实率在82.65%以上。可见，在相同的处理条件下，添加10%和30%增量剂的花粉TTC染色率及田间结实率明显高于无增量剂的花粉。

2.2 不同贮藏时间下，增量剂与温度互作对TTC染色率及田间结实率的影响

2. 2. 1 TTC染色率 从表2可知，无增量剂、处理温度为-5、5和10 ℃的玉米花粉，贮藏1 d内TTC染色率无显著变化（P>0.05，下同），平均为96.74%，贮藏3 d后活力显著下降（P<0.05，下同），平均为68.59%，贮藏5 d后，平均为25.24%;10%增量剂、处理温度为5和10 ℃的玉米花粉，贮藏1 d的TTC染色率平均为95.78%，贮藏3 d平均为95.66%，贮藏5 d后活力有所下降，但仍然有81.35%以上的TTC染色率，而处理温度为15和25 ℃的玉米花粉贮藏1 d后活力显著下降，TTC染色率平均为78.49%，贮藏3 d平均只有29.03%。可见，花粉活力随温度的增加及贮藏时间的延长而下降，温度越高，花粉活力随贮藏时间延长下降越快，越不耐贮藏。30%增量剂条件下玉米花粉活力变化规律与10%增量剂相同，TTC染色测定的花粉染色率与田间结实率指标表现基本一致，与无增量剂及100%增量剂相比，10%和30%增量剂的花粉活力在贮藏过程中出现下降时间更晚，下降速度更慢。说明在相同的贮藏条件下，10%和30%增量剂的花粉比无增量剂及100%增量剂的花粉更耐贮藏。

2. 2. 2 田间结实率 由表3可知，在相同的处理条件下，金卡HM608田间结实率变化规律与其父本花粉活力变化相似，处理温度为-5、5和10 ℃的玉米花粉，无增量剂时，贮藏1 d，田间结实率无显著变化，平均为91.27%;贮藏3 d，田间结实率显著下降，平均为60.57%;贮藏5 d，田间结实率平均只有13.68%;而添加10%和30%增量剂的花粉，贮藏5 d的田间结实率在61.22%以上;当增量剂比例为100%且贮藏5 d时，田间平均结实率仅为7.19%，当处理温度为15～25 ℃时，田间结实率为0。由此可见，在相同的处理条件下，10%～30%增量剂的花粉较无增量剂及100%增量剂的花粉田间结实率更高。

从表2和表3还可看出，当TTC染色率低于10% 时，田间结实率基本为0，处理温度大于10 ℃且增量剂比例大于30% 时，花粉活力随温度上升和贮藏时间延长呈下降趋势，当温度进一步升高，花粉活力过低并迅速下降至接近0的水平，已失去贮藏意义。

2. 3 不同增量剂比例花粉的TTC染色率与田间结实率的相关分析

从表4相关分析结果来看，不同增量剂比例花粉的TTC染色率与甜玉米的田间结实率均呈正相关关系，相关系数为0.980～0.990，相关性均达极显著水平（P<0.01），说明花粉的TTC染色率越高，其田间结实率就越高。

3 讨论

滑石粉是一种白色柔软的疏水性物质，属天然的单斜晶系水合硅酸盐，由31.7%的氧化镁、63.5%的二氧化硅及4.8%的水组成，化学稳定性良好，流动性好，具有润滑、抗黏、助流、耐高温等优良特性（殷代武和谭卉文，2013）。滑石粉由于其分散性能好，可有效阻挡花粉粒之间相互聚集，疏水抗黏，防止糖化结块，最早被利用掺在花粉中的主要目的是稀释杂交育种父本花粉，节省花粉用量。20世纪80年代后期日本曾研制出在比重、颗粒大小、生物学特性等方面与农作物相近的植物孢子“石松子”，经过染色作为花粉增量材料，因其特性优异，被应用于植物人工授粉作业（宋志强和朱勇，2007），但可能由于生产成本过高未能得到广泛应用。本研究中，利用价格低廉、容易购买的滑石粉作为玉米花粉增量剂，探讨离体玉米花粉与滑石粉按不同比例混合后，花粉在不同处理温度和贮藏时间下的生活力，研究结果发现，利用10%～30%滑石粉作为增量剂，-5～10 ℃温度贮藏1～3 d，田间结实率保持在82.26%以上，贮藏5 d田间结实率仍保持在61.22%以上。王霞等（2013）研究表明，离体玉米花粉在4 ℃条件下贮藏5 d的平均田间结实率为30%。本研究在添加10%～30%滑石粉增量剂的情况下，田间结实率高于王霞等（2013）的研究结果，表明在常温或低温条件下，添加适量滑石粉作为增量剂可大幅提高玉米花粉的生活力和田间结实率。

不同贮藏条件下花粉耐贮藏性不同（赵婵璞等，2014）。本研究中，添加10%滑石粉增量剂的玉米花粉分别贮藏3和5 d，发现10 ℃处理的田间结实率高于-5和5 ℃处理，可能与空气湿度和花粉相对含水量有关。处理温度为-5和5 ℃使用家用冰箱储存花粉，处理温度为10 ℃使用干燥箱储存花粉。研究表明，未经干燥的花粉细胞自由水含量较高，花粉在低温贮藏过程中易形成细胞内结晶，引起细胞破裂，导致花粉活力降低（常维霞等，2018），从而影响田间结实率，与任转滩等（2008）、郑飞等（2015）所得的结论一致，至于玉米花粉保存过程中的干燥时间、干燥强度等对贮藏效果的影响程度，还有待进一步探讨。此外，本研究还发现，-5～10 ℃温度下10%滑石粉增量剂处理的花粉贮藏3 d，田间结实率为91.17%;贮藏5 d的田间结实率为72.28%，均高于30%滑石粉增量剂处理，表明10%滑石粉增量剂处理的储藏效果优于30%滑石粉增量剂处理，当滑石粉比例在100%且贮藏期为5 d时，田间平均结实率为7.19%，当保存温度为15～25 ℃时，田间结实率为0，表明增量剂比例和温度过高均不利于花粉的保存。滑石粉过多会降低花粉活力和田间结实率，其主要原因可能有四方面：第一，滑石粉不含营养成分，不能提供花粉萌发所需的营养元素（碳水化合物）;第二，由于滑石粉吸附力强（李萍等，2013），易包围整个花粉粒，而且质量较重，容易压迫花粉粒，造成花粉细胞形态结构异常，使花粉粒畸形，堵塞花粉萌发孔，影响花粉管发育;第三，当滑石粉散落的玉米雌蕊柱头上时，占据了雌蕊柱头上的受精点位，使花粉管不能顺利进入雌蕊柱头进行受精，造成精核错过雌蕊的最佳受精时间，从而影响玉米结实率（逯明辉等，2009）;第四，滑石粉晶体呈假六方或菱形的片状，容易损伤花粉粒外壁结构，导致生活力减弱，甚至完全丧失受精能力（降志兵等，2016）。

玉米花粉活力主要受两个因素影响，一是自身遗传特性，二是外部环境因素影响，如温度、湿度、贮藏媒介种类、光照强度等（刘芳和周蕴薇，2007;Shtereva et al.，2015）。玉米花粉贮藏技术的研究和应用，一是为保护种质资源，二是克服育种或制种过程中杂交亲本的花期不遇问题。例如在海南省玉米父母本错期为7 d，由于南北气候的差异，在甘肃省玉米父母本错期将会超过20 d以上，当未能准确把握父母本错期时，利用贮藏技术将花粉保存3～5 d，可大大减少制种风险，在实际生产应用中还可减少父本播种批次，增加母本种植面积，从而增加制种产量，降低制种成本。另一方面，广东地区甜玉米制种授粉时期在9—10月，白天温度常在30 ℃以上，气温高、湿度大，滑石粉以其分散性能好、疏水抗黏、防止糖化结块的特性，已广泛应用于甜玉米雜交制种的授粉作业中，只是未对添加滑石粉后玉米花粉的耐贮藏性作深入研究。本研究只针对一个甜玉米自交系材料的花粉进行研究，虽然代表性略显不足，但仍为研究花粉贮藏方法提供了新思路。

4 结论

保存温度在-5～10 ℃，添加10%和30%滑石粉作为甜玉米花粉增量剂能有效延长花粉生活力。该贮藏方法简单实用，要求条件不高，一般在家用电冰箱中即可贮藏，能有效解决杂交亲本之间花期不遇，或者远距离杂交的问题，对于指导授粉工作、减少制种风险、提高制种产量具有现实意义。

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（責任编辑 王 晖）