8个番荔枝栽培品种的花粉形态扫描电镜观察

方仁 安振宇 黄伟雄 白先进 尧金燕 龙兴 周双云 张继

摘要：【目的】明確番荔枝常见栽培品种的花粉形态特征及各品种间的亲缘关系，为番荔枝品种的分类鉴定研究提供理论依据。【方法】利用冷场发射扫描电镜技术，对8个番荔枝栽培品种的花粉形状、花粉大小及花粉外壁纹饰等形态特征进行观察，并进行主成分和聚类分析。【结果】供试番荔枝品种的花粉外部形态均呈长球形，花粉以四合体形式存在，辐射对称，极面观呈近圆形或菱形或四角形，赤面观呈近椭圆形，无萌发沟;各品种的花粉形状、花粉大小及花粉外壁网孔密度和大小均存在差异，其中，花粉大小为489.46～721.80 ?m2，极轴长为25.85～31.10 ?m，赤道轴长为18.93～23.15 ?m;花粉外壁均为网状饰纹，网孔直径为0.22～0.33 ?m，网孔密度为1.61～2.60 n/?m2。非洲骄傲、吉夫纳和绿钻品种间的花粉大小、网孔直径和网孔密度等性状指标差异不明显，但与其他供试品种间存在显著差异（P<0.05）。花粉大小、极轴长、赤道轴长等特征指标与花朵的长度、花径宽度、鲜重等性状指标呈负相关。主成分分析结果显示，花粉外壁纹饰、花粉大小和花粉形状的差异可作为番荔枝品种分类的参考依据。而聚类分析结果显示，非洲骄傲、吉夫纳和绿钻3个品种的亲缘关系较接近，归为一类;其余栽培品种归为另一类。【结论】花粉形状、花粉大小和花粉壁纹饰等性状指标的差异可用作番荔枝品种（系）间亲缘关系及分类鉴定的孢子学依据。

关键词： 番荔枝;花粉形态;电镜扫描;亲缘关系

中图分类号： S667.9                                文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）07-1553-07

Abstract：【Objective】In order to clarify the pollen morphology and relationship among the cultivated Annona squamosa L. varieties， which provided theoretical basis for the classification and identification of the varieties. 【Method】Cold field emission scanning electron microscopy was used to observe pollen traits ， size and exine ornamentation morphology of eight cultivated A. squamosa varieties， and principal component analysis and cluster analysis were conducted. 【Result】The pollen morphology of eight cultivated A. squamosa varieties were in the form of prolate， which was radially symme-tric and existed in tetrahedral form， the polar view was nearly circular or diamond or quadrangle， while the equatorial view was nearly ellipse， without germ furrow. Their pollen surface characteristics， pollen size， mesh density and mesh diameter were different， the pollen grain size were 489.46-721.80 ?m2， the polar axis length were 25.85-31.10 ?m， the equator axis length were 18.93-23.15 ?m， the pollen exine ornamentation were reticular ornamentation， the mesh diameter sizes were 0.22-0.33 ?m， the mesh density were 1.61-2.60 n/?m2. The difference in pollen size， mesh diameter and mesh density among AP， Gefner and Lüzuan were not obvious， but were significantly different from other varieties（P<0.05）. And the pollen grain size， polar axis length and equator axis length had negative correlation with the length， diameter width and fresh weight of flowers. The results of principal component analysis showed that the differences of pollen exine ornamentation， pollen size and pollen shape could be used as reference for the classification of the A. squamosa varie-ties. And through the cluster analysis of pollen quantitative characteristics， it was found that the genetic relationship among the three varieties of AP， Gefner and Lüzuan， their genetic distance were more closely related and fall into one group. Other cultivated varieties belong to another group. 【Conclusion】There are some differences among the pollen grain shape， size and surface ornamentation， which can provide some evidences for the identification of inter-varieties（lines） kinship and classification of A. squamosa cultivars.

Key words： Annona squamosa L.; pollen morphology; scanning electron microscopy; genetic relationship

Foundation item： Key Research and Development Project of Guangxi（Guike AB19245004）;Guangxi Innovation Driven Development Project（Guike AA17204097-7，Guike AA17204026）;Guangxi Innovation Team Project of National Modern Agricultural Industry Technology System（nycytxgxcxtd-17-15）

0 引言

【研究意义】番荔枝（Annona squamosa L.）又称释迦，为番荔枝科（Annonaceae）番荔枝属（Annona）多年生半落叶性小乔木，起源于热带美洲及西印度洋群岛（高爱平等，2003），在我国已有400多年的栽培历史，主要分布于广东、广西、云南、海南、福建和台湾等地，但因栽培技术落后和新品种匮乏，一直以来未能充分发挥其优稀特色水果的商品性优势。近年来，随着人们对番荔枝营养价值与经济价值的深入了解，越來越多种植户开始倾向于种植番荔枝，由此刺激各地区加大对品种引进与选育的力度，使得栽培品种不断丰富。番荔枝在国内的研究起步较晚，当前栽培品种遗传背景复杂，各品种间植株外观形状较相似，肉眼上难以鉴别，品种间的亲缘关系尚未完全阐明。通过花粉形态鉴别植物的种和品种在果树上已得到广泛应用（薛晓敏等，2012），因此，开展花粉形态观察与分析，对鉴别番荔枝品种、了解品种间的亲缘关系及促进番荔枝产业健康发展具有重要意义。【前人研究进展】植物的花粉形态特征仅受基因控制，具备较强的保守性与遗传稳定性，可为种间亲缘关系、系统发育和分类鉴定的研究提供可靠依据（陈常颂等，2012）。刘永和徐凤霞（2012）利用扫描和透射电子显微镜观察了番荔枝科4属4种植物的花粉形态与结构，发现不同属或同属不同种间的花粉形态特征差异明显，多样性非常丰富;李晓娟等（2013）采用光学显微镜和扫描电镜相结合，发现山东丹参、丹参、南丹参的花粉形态、花粉大小和花粉外壁网状雕纹特征均具有较显著区别，为揭示其亲缘关系及种间分类鉴定提供了依据;张勇梅等（2014）利用扫描电子显微镜对番荔枝科2属3种植物干花粉形态进行观察，发现Asimina和Disepalum两属植物花粉表面纹饰、四合体类型等较相似，两者在系统发育中的亲缘关系较近;齐秀娟等（2017）利用扫描电镜对30个猕猴桃品系的花粉进行形态观察，通过分析萌发沟长度和沟脊宽度、极轴长度、赤道轴长度、极轴/赤道、花粉大小及外壁纹饰等，进一步明确猕猴桃花粉的外观形态与种间分类;谢微微等（2018）通过扫描电镜分析茶树花粉的微形态，14个茶树品种的花粉形状和外壁纹饰的细微结构与萌发器官均呈种内多样性和异质性，可作为品种鉴别的重要依据。【本研究切入点】番荔枝花粉超微结构在植物系统分类的研究报道较少，仅郑颖颖等（2016）对2个番荔枝栽培品种的花粉形态有过简要描述，有关花粉超微形态特征描述还不够深入，所涉及的花粉形态指标和品种也较少。【拟解决的关键问题】利用冷场发射扫描电镜，对8个我国南方地区常见番荔枝栽培品种的花粉形态、花粉大小和花粉外壁饰纹特征等形态特征进行观察与比较，旨在为鉴定品种的亲缘关系与分类研究提供理论依据。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试的8份番荔枝栽培品种花粉均采自广西农业科学院园艺研究所番荔枝资源保存圃，分别为：非洲骄傲（A. atemoya H cv. AP）、吉夫纳（A. atemoya H cv. Gefner）、泰国大果（A. squamosa L cv. Damu）、绿钻（A. atemoya H cv. Lüzuan）、软枝种（A. squamosa L cv. Soft Branch）、台东二号（A. squamosa L cv. TD No.2）、细鳞种（A. squamosa L cv. Thin Scale）和紫色种（A. squamosa L cv. Purple）。供试品种均为2015年4月定植的嫁接苗，2016年4月首次成花，树体水肥管理水平一致。2019年调查各品种的花期及花朵性状（表1）。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 花粉采集与保存 试验于2019年5月番荔枝供试品种自然花的盛花期进行。分别采集树冠外围不同方向中上部雄蕊成熟的正常花朵，掰去花瓣，用软毛刷轻扫花朵上的雄蕊群后，将蘸在软毛刷上的花粉轻弹于电镜固定液中，室温下摇匀固定2 h，转移至4 ℃低温保存备用。

1. 2. 2 扫描电镜观察 将固定好的花粉经0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）漂洗3次，每次15 min;之后依次加入30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%和100%酒精进行梯度脱水，每个梯度浓度浸泡15 min;再置于临界点干燥仪内干燥;将花粉紧贴于导电碳膜双面胶上放入离子溅射仪样品台上喷金30 s左右;然后置于Regulus 8100型冷场发射扫描电镜观察并拍照。每个品种观察10粒花粉，选取具有代表性的视野观察花粉形态特征，1000×视野下观察极面观、2000×视野下观察赤道面观、30000×视野下观察外壁纹饰;用AutoCAD2004测量极轴长（P）、赤道轴长（E）和网孔直径;P×E表示花粉大小，参照王开发和王宪曾（1983）的方法测定;P/E表示花粉形状，P/E>2.00为超长球形，1.33

1. 3 统计分析

试验数据采用Excel 2007和STAT-200进行统计分析，品种间显著性差异采用Duncans新复极差法进行比较。利用PASW statistics 18.0对花粉赤道轴长、极轴长、网孔直径和网孔密度等形态指标的定量数据进行标准化转换，并开展花粉形态指标与花朵性状的相关分析;采用因子分析法开展主成分分析，采用组间联接法和欧氏距离法开展聚类分析。

2 结果与分析

2. 1 不同番荔枝栽培品種花粉形态特征比较

冷场发射扫描电镜对8个番荔枝栽培品种花粉形态的观察结果如图1与表2所示。在外部特征上，供试番荔枝花粉均以四合体形式存在，辐射对称，赤面观呈近椭圆形，无萌发沟;非洲骄傲、吉夫纳和绿钻的极面观呈近圆形，其余品种呈菱形或四角形;非洲骄傲、吉夫纳和绿钻的花粉表面较细腻，其余品种花粉表面干瘪粗糙。从花粉形状来看，8个番荔枝栽培品种的花粉基本形状均为长球形，其中紫色种花粉的P/E为1.51，与泰国大果（1.44）差异不显著（P>0.05，下同），但显著大于其他供试品种（P<0.05，下同）。从花粉大小来看，非洲骄傲、吉夫纳和绿钻的花粉大小分别为489.46、499.62和503.02 ?m2，显著小于其他供试品种。从极轴长来看，细鳞种的极轴长最大，为31.10 ?m，与软枝种（30.69 ?m）、台东二号（29.84 ?m）、泰国大果（28.92 ?m）和紫色种（28.70 ?m）无显著差异，但显著大于非洲骄傲（25.85 ?m）、吉夫纳（25.86 ?m）和绿钻（26.41 ?m）。从赤道轴长来看，细鳞种和软枝种的赤道轴长分别为23.15和22.90 ?m，与台东二号（21.52 ?m）和泰国大果（20.04 ?m）无显著差异，但显著大于吉夫纳（19.32 ?m）、绿钻（19.16 ?m）、紫色种（19.02 ?m）和非洲骄傲（18.93 ?m）。由此可见，番荔枝花粉的外部形状、赤道轴长和极轴长等特征在不同品种间存在一定差异，可作为区分不同品种的辅助依据。

2. 2 不同番荔枝栽培品种的花粉外壁纹饰观察

8个番荔枝栽培品种在冷场发射扫描电镜下的花粉外壁纹饰特征如图1-3、1-6、1-9、1-12、1-15、1-18、1-21、1-24所示，供试品种花粉外壁均为网脊与孔穴组成的网状饰纹，网脊面略凸起或凸起明显，且分布有横纵交叉的细小裂纹。花粉外壁上网孔大小及分布密度等物理性状在不同品种间存在差异（表3）。其中，非洲骄傲的网孔直径为0.33 ?m，与吉夫纳（0.31 ?m）和绿钻（0.31 ?m）无显著差异，但显著大于台东二号（0.28 ?m）、紫色种（0.28 ?m）、泰国大果（0.27 ?m）、细鳞种（0.26 ?m）和软枝种（0.22 ?m）。细鳞种和软枝种的网孔密度分别为2.60和2.46 n/?m2，与台东二号（2.32 n/?m2）和紫色种（2.30 n/?m2）均无显著差异，但这4个品种网孔密度显著大于绿钻（1.70 n/?m2）、吉夫纳（1.65 n/?m2）和非洲骄傲（1.61 n/?m2）3个品种。

2. 3 花粉形态指标与花朵性状的相关性

从番荔枝栽培品种的性状指标相关分析结果（表4）可知，花粉极轴长与花朵长度、花朵鲜重呈极显著负相关（P<0.01），与花径宽度呈显著负相关;花粉赤道轴长与花朵长度、花径宽度和花朵鲜重均呈负相关，但相关性不显著;花粉大小也与花朵长度、花径宽度和花朵鲜重呈负相关，其中，与花朵长度和花朵鲜重相关性显著。可见，供试番荔枝花朵外观性状决定花粉形态特征指标，花朵表观特征越大，其花粉形状特征则越小。但该结论所涉及植物外观形态指标过少，是否可作为番荔枝品种间分类鉴定的依据还有待进一步证实。

2. 4 花粉形态的主成分分析结果

通过主成分分析可探讨各分类单位花粉形态的主要差异，以及尽可能从花粉形态上获取品种亲缘关系的相关信息（郑雅馨等，2013）。由表5和表6可知，前2个主成分的累积贡献率达96.881%，已包含供试样品原始性状的大部分信息。其中，第一主成分的贡献率为75.852%，特征向量绝对值较高的是网孔密度、极轴长、网孔直径和花粉大小，其反映了外壁纹饰和花粉大小的性状;第二主成分的贡献率为21.029%，特征向量绝对值较大的是P/E，说明花粉形状也是番荔枝品种分类的重要指标之一。综合第一主成分和第二主成分可得出，影响番荔枝花粉分类的性状指标主要有外壁纹饰、花粉大小和花粉形状。

2. 5 花粉形态的聚类分析结果

聚类分析结果如图2所示，以欧氏距离10水平来划分，8个番荔枝品种大致可分为两大类群，第I类群包括非洲骄傲、吉夫纳和绿钻3个品种，其亲缘关系较接近，长球形花粉大小为489.46～503.02 ?m2，网孔直径0.31～0.33 ?m，网孔密度1.61～1.72 n/?m2;第II类群包括软枝种、细鳞种、泰国大果、台东二号和紫色种5个品种，长球形花粉大小为546.31～721.80 ?m2，网孔直径0.26～0.28 ?m，网孔密度2.08～2.60 n/?m2，其中，软枝种和细鳞种亲缘较近，泰国大果、台东二号和紫色种的亲缘关系也较近。由此可见，通过番荔枝花粉形态的花粉大小、网孔大小和网孔密度等数量特征聚类分析可大致反映不同品种间的亲缘关系。

3 讨论

植物花粉的形态特征不易受外界条件所影响，具有较强的遗传保守性，其遗传信息可为植物的系统分类与品种鉴定提供可靠的理论依据（杨林先等，2010;陈常颂等，2012）。本研究通过冷场发射扫描电镜对8个番荔枝栽培品种的花粉形态进行观察，发现供试品种的花粉均以四合体形式存在，辐射对称，花粉呈长球形，无萌发沟，说明番荔枝各品种间的花粉外观形状差异较少。本研究还发现供试番荔枝品种的花粉大小、极轴长度、赤道轴长度、极轴/赤道轴、网孔密度和网孔直径等方面均存在差异，与邓穗生等（2012）对6种番荔枝属果树的雄蕊特征观察结果基本一致，均认为雄蕊的花粉大小及外壁部分特征因树种的不同而有所差异;其中非洲骄傲、吉夫纳和绿钻品种间的花粉大小、网孔直径和网孔密度等性状指标差异不明显，但与其他供试品种间存在显著差异，说明3个品种具有较近的亲缘关系，可分类为区别于细鳞种、软枝种、台东二号、紫色种和泰国大果的种类。通过花粉形态的主成分分析也发现，依据花粉外壁纹饰、花粉大小和花粉形状等性状指标也能对番荔枝品种开展分类，与郑雅馨等（2013）利用花粉形态主成分分析地被菊和部分菊属近缘种的结果较接近。

植株品种间具有独特的花粉形态，其指标数据稳定，在进行品种分类时具有较高的区分效率，可初步作为种属间分类和品种鉴定的参考依据，其中花粉形态的数量特征聚类分析可大致反映不同种及品系间的亲缘关系（钟敏等，2016;李京璟等，2017;刘伟等，2018）。本研究的聚类分析结果表明，在欧氏距离10的水平上，8个番荔枝栽培品种可初步分为两大类群，第I类群包括非洲骄傲、吉夫纳和绿钻，其品种间亲缘关系较接近，在花粉形態、花粉大小及花粉外壁特征上均与第II类群存在明显的差异。虽然本研究初步了解了番荔枝栽培品种间的亲缘关系与分类，但由于聚类分析未能充分包含植株花粉及外观形状等定性特征，因此，研究结果仅可为番荔枝品种间的分类鉴定提供参考。为更详细与准确地判定番荔枝品种间亲缘关系与分类，还有待对植株花粉的纹饰、网纹排列、网眼形状和萌发孔等定性描述特征，以及结合植株形态学、遗传学、细胞学、分子生物学等方面进行深入研究。

4 结论

不同番荔枝栽培品种间的花粉形态特征存在一定差异，尤其是花粉的形状、花粉大小及花粉外壁纹饰等性状指标的差异，体现了不同番荔枝品种间存在相应的遗传多样性与遗传分化，可用作品种（系）间亲缘关系及分类鉴定的孢子学依据。

参考文献：

陈常颂，彭艾，钟秋生，王秋萍，陈荣. 2012. 34份茶树种质的花粉形态特征研究[J]. 福建农业学报，27（11）： 1219-1226. [Chen C S，Peng A，Zhong Q S，Wang Q P，Chen R. 2012. Morphological studies on pollen of camellias for 34 species（Camellia sinensis）[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences，27（11）： 1219-1226.]

邓穗生，高爱平，陈业渊. 2012. 6种番荔枝属果树雄蕊特性的研究[J]. 热带作物学报，33（9）： 1654-1658. [Deng S S，Gao A P，Chen Y Y. 2012. Characteristics of the stamens of six Annona spp.[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，33（9）： 1654-1658.]

高爱平，陈业渊，李建国，李绍鹏，邓穗生. 2003. 番荔枝属果树栽培研究进展[J]. 热带作物学报，24（2）： 91-97. [Gao A P，Chen Y Y，Li J G，Li S P，Deng S S. 2003. Research advances on cultivation of Annona[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，24（2）： 91-97.]

李京璟，张日清，马庆华，王贵禧. 2017. 榛属植物花粉形态扫描电镜观察[J]. 电子显微学报，36（4）： 404-413. [Li J J，Zhang R Q，Ma Q H，Wang G X. 2017. SEM observation on the pollen morphology in Corylus[J]. Journal of Chinese Electron Microscopy Society，36（4）： 404-413.]

李晓娟，李建秀，孙经兴，宋英杰，张永清. 2013. 扫描电镜下山东丹参与近缘种花粉形态特征比较观察[J]. 广西植物，33（1）： 20-24. [Li X J，Li J X，Sun J X，Song Y J，Zhang Y Q. 2013. Observation and comparison on morphological characteristics of pollen of Salvia shandongensis ang its relatives by SEM[J]. Guihaia，33（1）： 20-24.]

刘伟，李桂祥，董晓民，李勃，韩真，张安宁. 2018. 肥城桃花粉形态观察[J]. 果树学报，35（1）： 38-45. [Liu W，Li G X，Dong X M，Li B，Han Z，Zhang A N. 2018. Observation on pollen grains of Feicheng peaches[J]. Journal of Fruit Science，35（1）： 38-45.]

刘永，徐凤霞. 2012. 四种番荔枝科植物花粉形态[J]. 植物分类与资源学报，34（5）：443-452. [Liu Y，Xu F X. 2012. Po-llen morphology of four selected species in the Annonaceae[J]. Plant Diversity and Resources，34（5）： 443-452.]

齐秀娟，王然，兰彦平，陈锦永，顾红，方金豹. 2017. 3个猕猴桃栽培种花粉形态扫描电镜观察[J]. 果树学报，34（11）： 1365-1373. [Qi X J，Wang R，Lan Y P，Chen J Y，Gu H，Fang J B. 2017. Morphologic study of pollens of three cultivated Actinidia species by scanning electron microscopy[J]. Journal of Fruit Science，34（11）： 1365-1373.]

王开发，王宪曾. 1983. 孢粉学概论[M]. 北京：北京大学出版社： 59-71. [Wang K F， Wang X Z. 1983. Introduction to palynology[M]. Beijing：Peking University Press：59-71.]

谢微微，于文涛，杨国一，陈静，潘玉华，叶乃兴. 2018. 14个茶树品种的花粉微形态观察[J]. 南方农业学报，49（9）： 1698-1704. [Xie W W，Yu W T，Yang G Y，Chen J，Pan Y H，Ye N X. 2018. Micromorphological observation on pollen of 14 cultivars of tea tree（Camellia sinensis）[J]. Journal of Southern Agriculture，49（9）： 1698-1704.]

薛晓敏，王金政，路超，王贵平. 2012. 苹果专用授粉品种和栽培品种花粉形态扫描电镜观察[J]. 华南农业大学学报，33（2）： 188-191. [Xue X M，Wang J Z，Lu C，Wang G P. 2012. SEM observation on the pollen morphology of pollinated species and cultivars in apple[J]. Journal of South China Agricultural University，33（2）： 188-191.]

杨林先，李伟，严花淑，曲柏宏. 2010. 部分梨树品种花粉形态观察[J]. 河南农业科学，（3）： 78-82. [Yang L X， Li W， Yan H S， Qu B H. 2010. Morphology observation of po-llen of some pear varieties[J]. Journal of Henan Agricultural Sciences，（3）： 78-82.]

张勇梅，阳桂芳，徐凤霞. 2014. 3種番荔枝科植物花粉形态观察[J]. 植物科学学报，32（4）： 315-319. [Zhang Y M，Yang G F，Xu F X. 2014. Pollen morphology of three selected species from Annonaceae[J]. Plant Science Journal，32（4）： 315-319.]

郑雅馨，陈雪鹃，孙明. 2013. 地被菊及部分菊属近缘种花粉形态分析[J]. 上海农业学报，29（4）： 47-51. [Zheng Y X，Chen X J，Sun M. 2013. Morphological analysis on po-llens of several ground-cover chrysanthemum cultivars and their allied species[J]. Acta Agriculturae Shanghai，29（4）： 47-51.]

郑颖颖，黄桂香，潘介春，李菊馨，秦霞，吴琳，裴艳艳. 2016. 番荔枝花粉形态和授粉亲和性观察研究[J]. 中国南方果树，45（4）： 18-22. [Zheng Y Y，Huang G X，Pan J C，Li J X，Qin X，Wu L，Pei Y Y. 2016. Observation on po-llen morphology and pollination compatibility of atemoya（Annona cherimoya×A. squamosa）[J]. South China Fruits，45（4）： 18-22.]

钟敏，谢敏，张文标，陶俊杰，黄春辉，朱博，徐小彪. 2016. 野生毛花猕猴桃雄株居群花粉形态观察[J]. 果树学报，33（10）： 1251-1258. [Zhong M，Xie M，Zhang W B，Tao J J，Huang C H，Zhu B，Xu X B. 2016. Observation on the pollen morphology of male geotypes in wild Actinidia eriantha population[J]. Journal of Fruit Science，33（10）： 1251-1258.]

（责任编辑 邓慧灵）