HPLC法分析叶用芥菜种子中莱菔硫烷含量

兰梅 杨红丽 胡靖锋

摘要：为了筛选富含莱菔硫烷的叶用芥菜材料，以20份叶用芥菜种子为试材，采用高效液相色谱法（HPLC）测定芥菜种子中的莱菔硫烷含量，分析不同品种之间的莱菔硫烷含量变化规律。结果表明，20份叶用芥菜材料种子中莱菔硫烷含量为11.79～226.72 mg/kg（DW），供试材料间莱菔硫烷含量差异达显著水平，并获得1份莱菔硫烷含量较高的材料（太乐四季青），含量为226.72 mg/kg（DW）;1份莱菔硫烷含量最低的材料（圆叶春菜），含量为11.79 mg/kg（DW），最高含量约是最低含量的19.2倍，是研究莱菔硫烷含量变化规律的优良材料，也为下一步深入开展莱菔硫烷代谢机理研究奠定了基础。

关键词：叶用芥菜;莱菔硫烷;高效液相色谱（HPLC）

中图分类号：S637.2         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）17-0154-04

Abstract： In order to get the resources of leaf mustard with abundant sulforaphane，seeds of twenty cultivars were used to analyze and compare the  contents of sulforaphaneby high performance liquid chromatography （HPLC）. The results showed that the range ofvariatoin of sulforaphane was 11.79～226.72 mg/kg（DW） with significant differences among tested lines. The material （Tai le sijiqing） with highest content of sulforaphane，which is 226.72 mg/kg （DW），was about 19.2 times compared with the lowest one （Spring cobbage with round leaves） which is 11.79 mg/kg （DW）. It provides an foundational material for further research on rule of variation and the mechanism of metabolism of sulforaphan.

Key words： leaf mustard; sulforaphane; high performance liquid chromatography （HPLC）

叶用芥菜（Brassica juncea Coss. var. foliosa Bailey）原产中国，简称叶芥菜，别名青菜、腊菜、春菜，是十字花科芸薹属芥菜种中以叶或叶球为产品的变种。喜冷凉湿润气候，适应性较强，品种繁多，长江流域以南的地区栽培较为普遍[1]。流行病学研究发现，经常食用十字花科的蔬菜，可以降低癌症发生几率[2]。十字花科蔬菜化学防癌效果主要归功于异硫氰酸酯（Isothiocyanates）强有力的防癌、抗癌功能[3]。而莱菔硫烷（sulforaphane，SF）是异硫氰酸酯类物质中生物学活性最强的物质[4]，国内外研究发现，莱菔硫烷能够预防肺癌[5]、乳腺癌[6]、肝癌[7]、结肠癌[8]、胃癌[9]等疾病的发生;同时对治愈心脑血管疾病和近视也有一定的效果[10，11]。在抗癌新药开发与流行病学研究方面具有重要的社会价值与科研价值[12]。因此，挖掘富含莱菔硫烷的叶用芥菜资源，为选育芥菜抗癌新品种及研究莱菔硫烷活性提供材料和依据。

莱菔硫烷又稱萝卜硫素，是硫苷中的4-甲亚磺酰基丁基硫甙（Glucoraphane，GRA）[13]与黑芥子酶发生水解反应的次生代谢产物[12]，该物质是蔬菜中发现的抗癌活性较强的有效成分之一[14]。莱菔硫烷的检测方法有气相色谱（GC）、气相色谱-质谱（GC-MS）、超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）[13]和高效液相色谱（HPLC）[15，16]。有关十字花科植物中莱菔硫烷的含量测定已有文献报道[3，17]。当前对莱菔硫烷的报道多集中在青花菜上，何洪巨等[18]、夏薇等[19]、Liang等[20]、张婵娟等[21]都证实了青花菜富含莱菔硫烷成分，并且分布在不同的营养器官中，如花球、茎和种子等，采用的检测方法主要为高效液相色谱法（HPLC）[12]。李占省等[22]对29份青花菜和48份甘蓝的不同器官中莱菔硫烷含量进行了HPLC分析，发现花球、叶片和幼茎中的莱菔硫烷含量存在明显差异，花球中的含量最高。李占省等[12]对23份芥蓝纯合自交系和21份杂交F1材料花薹中的莱菔硫烷含量进行了测定，不同材料中莱菔硫烷含量差异较大。王丽红等[23]对十字花科植物光果葶苈中的莱菔硫烷含量进行了测定，并优化了HPLC法检测光果葶苈中莱菔硫烷含量的方法。对芥菜种子中莱菔硫烷含量的研究未见报道，本试验以20份叶用芥菜高代纯合自交系种子为材料，利用HPLC法测定其莱菔硫烷含量，旨在筛选出莱菔硫烷含量较高的叶用芥菜材料，为选育新品种及材料创新提供依据，为进一步满足人们的多样化需求奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

安捷伦高效液相色谱仪系统（美国安捷伦公司）：Agilent 1100 四元泵;Agilent 柱温箱;Agilent 色谱数据工作站;Agilent 二极管阵列紫外检测器。超声波清洗机 （昆山市超声仪器有限公司）;旋转蒸发仪（德国IKA）。

莱菔硫烷对照品（美国LKTTM，纯度≥98%），乙腈（色谱级），乙酸乙酯（分析纯），磷酸（优级纯），0.22 μm孔径的微孔滤膜 （上海兴亚公司）。

1.2 材料

试验所用材料由云南省农业科学院园艺作物研究所十字花科课题组提供，具体信息见表1。

1.3 方法

1.3.1 试样制备 分别准确称取0.20 g种子研磨成粉末状，置于通风橱内干燥（干燥后的样品避免受潮，用自封袋密封保存且放置于干燥低温环境中），分别加入6.0 mL pH 7.0的磷酸盐缓冲液（0.1 mol/L，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾），磁力搅拌器下反应   2.0 h（室温）后加入6 mL的乙酸乙酯（AR）混匀30 min后，4 000 r/min下离心10 min，收集上清液;再重复提取2次，收集3次的萃取液在旋转蒸发仪上蒸干，旋蒸温度为35 ℃，最后用6 mL乙腈定容，过0.22 μm滤膜后-20 ℃低温保存待测。

1.3.2 色谱条件 采用安捷伦系列高效液相色谱仪，反相C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流速1 mL/min;进样量20.0 μL;梯度洗脱法测定，流动相A泵为纯水液，B泵为100%的乙腈，梯度程序见表2。

1.3.3 线性方程、精密度、回收率

1）线性方程。以莱菔硫烷标准液（575 [μ]g/mL）配制成57.5、28.8、14.4、7.2、3.6、1.8 [μ]g/mL称释液分别进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，计算标准曲线和线性方程。

2）精密度测定。吸取浓度为14.4 μg/mL的莱菔硫烷溶液，反复进样测定6次（n=6），根据测得的峰面积计算精密度。

3）回收率测定。准确称取已知含量的芥菜种子样品，分别加入一定量的标准品溶液，按照前述的试样制备方法测定前后浓度，测定回收率。

1.4 数据处理

试验数据采用Excel软件和SPSS软件对检测结果进行方差分析和显著性检验（one-way ANOVA），数据用平均值（Mean）±标准差（SD）表示。

2 结果与分析

2.1 线性关系

量取57.5、28.8、14.4、7.2、3.6、1.8 μg/mL标准品稀释溶液，以20 μL进样，以峰面积（Y）对浓度（X）进行回归分析，得线性回归方程Y=0.000 8X+1.132 9，R2=0.998 6，表明莱菔硫烷的浓度在1.8～57.5 μg/mL与峰面积线性关系良好。

2.2 精密度与回收率

2.2.1 精密度 芥菜种子样品和莱菔硫烷标准品的目标峰保留时间基本一致，目标峰不受杂质干扰（图1和图2），表明该法能够准确检测出莱菔硫烷成分。吸取标准品溶液，反复进样测定6次，根据测得的标准品各成分峰面积，计算相对标准偏差RSD为1.17%，表明精密度良好（表3）。

2.2.2 回收率 在“1.3.2”色谱条件下测定莱菔硫烷的含量，样品的加樣回收率较高，平均回收率为97.13%（表4），RSD为1.08%。

2.3 芥菜种子中莱菔硫烷含量

从表5可以看出，20份芥菜材料种子中均检测到莱菔硫烷成分，供试材料间莱菔硫烷含量差异显著，具有统计学意义，且变化幅度较大。其含量为11.79～226.72 mg/kg（DW），其中14号材料含量最高，平均含量达到了226.72 mg/kg（DW）;其次是13号材料，平均含量为131.21 mg/kg（DW）;含量最低的是20号材料，平均含量为11.79 mg/kg（DW）;最高含量（14）是最低含量（20）的19.2倍，14号材料可作为高莱菔硫烷含量材料加以利用，进行新品种选育骨干亲本材料，也可作为抗癌芥菜新品种进行开发利用。

3 讨论

研究对20份叶用芥菜种子中的莱菔硫烷含量进行了HPLC分析，20份材料中都检测出了莱菔硫烷成分，并且品种之间的莱菔硫烷含量差异较大，得到了莱菔硫烷含量较高的材料，为高莱菔硫烷叶用芥菜新品种的选育与利用提供了材料。同时，本研究揭示了叶用芥菜在莱菔硫烷含量方面具有丰富的变化，是研究莱菔硫烷含量变化规律的优良材料，也为深入开展莱菔硫烷代谢机理研究奠定了基础。

目前，关于莱菔硫烷的研究多集中在青花菜、甘蓝、芥蓝等十字花科作物的研究上，李占省等[23]对甘蓝和青花菜不同器官中莱菔硫烷含量差异进行了研究，结果表明，不同甘蓝和青花菜基因型间莱菔硫烷含量差异显著，青花菜同一基因型不同器官中莱菔硫烷含量差异较大。李占省等[12]对芥蓝花薹中莱菔硫烷含量进行了HPLC分析，从44份芥蓝材料中获得了1份莱菔硫烷含量较高的F1材料，3份莱菔硫烷含量较高的高代纯合自交系材料。但是在芥菜上关于莱菔硫烷的研究还未见报道，本研究将为芥菜在莱菔硫烷上的研究奠定一定的基础。

有研究表明，莱菔硫烷及其前体RAA生成量与基因型紧密相关，Brown等[24]、Im等[25]和Farnham等[26]研究表明，基因型、基因型与环境的互作、环境均能影响RAA的生成量，其中基因型占总效应的50%～60%。Abercrombie等[27]、邱海荣等[28]和谢祝捷等[29]均推断莱菔硫烷及其前体RAA的合成主要受基因型调控，取样时期和基因型与环境的互作也能显著影响莱菔硫烷的变化。但是在芥菜中关于这方面的研究也未见报道，这也为下一步的研究提供了思路。

试验对20份叶用芥菜种子中的莱菔硫烷含量进行了测定，不同品种的芥菜种子中莱菔硫烷含量有明显差别，得到了1份莱菔硫烷含量较高的叶用芥菜材料，可考虑作为富含莱菔硫烷芥菜品种加以利用，丰富市场品种，也可作为抗癌芥菜亲本材料培育新品种。对芥菜中莱菔硫烷的遗传代谢机理进行研究，将有助于筛选出富含莱菔硫烷的芥菜新材料和抗癌新品种，但这方面尚待深入研究。

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