一株耐盐性α-淀粉酶高产菌的分离、鉴定及诱变选育

张伟　吴晓卫　姚彦红　张芬芬　周晓伦

摘要：从土壤中分离筛选出一株产α-淀粉酶的耐盐性菌株NWU-8，通过形态学、生理生化和16S rRNA基因序列分析，将NWU-8菌株鉴定为Halorubrum sp.，初始淀粉酶活力为32 U/mL。为提高该菌株产α-淀粉酶的能力，采用He-Ne激光照射手段对其进行诱变育种，所获突变株NWU-8-14产α-淀粉酶活力达到138 U/mL，产酶活力提升331%。此外，在盐浓度高达35%时，其α-淀粉酶活力仍然保持80 U/mL。NWU-8-14作为一种高产淀粉酶的噬盐菌在食品发酵及环境保护方面有广阔的应用前景。

关键词：淀粉酶;嗜盐菌;诱变;酶活力

中图分类号：TS201 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020） 16-0130-04

DOI： 10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.16.029

耐盐性α-淀粉酶是在含盐量较高的条件下能水解淀粉的酶类，广泛用于高盐环境下淀粉质原料的加工，如酱油的酿造[1]、工业副产品的加工[2]和垃圾的处理[3]等。特别是在高盐稀态酱油酿造过程中，由于盐水浓度的影响会导致普通微生物酶类失活而影响其水解和发酵作用，而在此过程中添加耐盐性淀粉酶可有效提高淀粉和还原糖的转化率，从而使原材料中的淀粉得以有效利用。其中，微生物淀粉酶以其易于大规模发酵和纯化等特点而被人们视为工业淀粉酶的重要来源。迄今为止，已有关于耐酸性淀粉酶产生菌、耐高温淀粉酶产生菌等的大量报道[4，5]，但是鲜有关于耐盐性淀粉酶产生菌应用于工业生产的报道。

为获得遗传性状稳定的耐盐性α-淀粉酶产生菌，本研究从陕西省定边县盐湖土壤分离得到1株耐盐性产淀粉酶的菌株NWU-8，并对其进行形态特征、生理生化和16SrRNA鉴定，结果显示该菌株为Halorubrum sp.。为提高其耐盐能力和产淀粉酶活力，运用He-Ne激光对其进行诱变育种，获得1株高产淀粉酶的耐盐性菌株NWU-8-14，以期为耐盐性淀粉酶产生菌的大规模发酵生产及在食品发酵和环境保护中的进一步应用提供参考。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 培养基

1） 培养基a：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 100g，去离子水 1 000 mL，pH 7.5。

2） 培养基b：酸水解酪蛋白5g，酵母浸膏12g，蛋白胨6g，可溶性淀粉10 g，柠檬酸三钠3 g，KCl 3 g，MgS04·7H20 18 g，FeS04·7H20 0.001 g，NaCl 100 g，去离子水 1000 mL，pH 7.5。

3） 培养基c：玉米粉30 g，玉米浆30 g，CaCl2 13 g，Na2HP043 g，（NH4）2S04 4 g，去离子水 1 000 mL，pH7.5。以上培养基均在1×105 Pa灭菌30 min。

1.1.2 土样采自陕西省定边县盐湖土壤。

1.2方法

1.2.1 嗜盐菌株分离 所采集的土壤样品经过2周自然干燥，取10g 土壤到90 mL无菌水中，置于摇床上150 r/min振荡30 min充分混勾，得到10-1 土样稀释液，再依次稀释到1×10-4/1×10-5和1×10-6，及取0.2 mL稀释液均匀涂布在培养基a平板上，30℃倒置培养72 h[6]。挑取单菌落反复划线，确保得到纯单菌并置于斜面（培养基a）保存。

1.2.2 产淀粉酶菌株筛选 选取斜面保存菌株接种于b培养基平板上，37℃恒温培养7 d，用卢氏碘液染色。对应菌株接入c液体培养基中进行37℃摇瓶发酵72 h，对发酵液离心，转速6 000 r/min，低温离心时间10 min，取上清液测定酶活力。根据菌落直径和染色圈大小，计算染色圈直径/菌落直径[6]，初步评价各菌株产淀粉酶的能力，确定产淀粉酶效果最佳菌株。每个操作重复3次。

1.2.3 菌株形态学与生理生化鉴定 采用显微镜观察菌体形态，参照《微生物学试验手册》[7]《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》[8]进行生理生化鉴定。

1.2.4 16S rRNA基因序列分析提取菌株的总基因组DNA，以此为模板，利用细菌16SrDNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3'）和1492R （5'-CTACGGTTACCTTGTTACGAC-3）进行PCR扩增。PCR反应体系25μL，热循环参数如下：94 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 1 min，55℃退火 1min，72 ℃延伸 2 min，循环 30 次，72℃延伸 10 min。琼脂糖凝胶电泳回收目的条带，并与pMD18-T载体连接，转化E.coli DH5α感受态细胞并进行菌落PCR验证，测序由西安交通大学第一附属医院完成。序列通过NCBI比对分析，采用Mega 4.0软件构建系统进化树[9]。

1.2.5 He-Ne激光诱变育种

1） 菌悬液制备。将培养7 d的斜面用无菌水冲洗，冲洗液盛放在已灭菌的含有玻璃珠的三角瓶中，在往复式摇床上150 r/min、37℃充分振荡培养30min，使菌株充分分散，诱变处理之前将菌悬液稀释至 1×106个/mL。

2） He-Ne激光诱变。用灭菌的移液管吸取2mL菌悬液，装入无菌试管（直径1 cm，壁厚0.1 cm）中，使用He-Ne激光器（波长为632.8 nm，光斑直径为1.5 mm）照射，照射距离为25 cm，输出功率为15 mW，照射时间分别设置为5、10、15、20、25和30min，原菌悬液作为空白对照组每个试验组均重复3次[10，11]。

3） 突變培养及性能检测。用灭菌的移液管吸取1 mL各试验组照射后的菌悬液，移入盛有无菌水的试管中，充分振荡混匀后进行梯度稀释，并涂布于初筛平板，观察菌落形态及菌落生长，原菌悬液为空白对照，试验重复3次。

统计初筛培养基上的平均菌落数，计算致死率[12]。若诱变后能够生长且菌落形态较大者为正突变株，反之，则为负突变株。

正变率=正突变株菌落数/诱变前菌株数×100% （1）

致死率=（对照组菌落数-处理组菌落数）/对照组菌落数×100%（2）

1.2.6 淀粉酶活性测定

1） 淀粉酶的初提。将1mL（0D值为2.1）菌液分别接种于25 mL基础培养基（5%～20%的盐浓度，pH 8.5），220 r/min，28 ℃培养 5 d。取 2 mL 培养液，6 000 r/min低温离心10 min，上清液即作为酶的初提液，用于活性检测[13]。

2） 淀粉酶活力测定。采用3，5-二硝基水杨酸比色（DNS）法测定淀粉酶活力[14，15]。

3） 酶活力的定义与计算。将37℃，20 min内1mL酶初提物产生1μg葡萄糖所需的酶量定义为1个酶活力单位[16]。

1.2.7 野生菌株和突变株所产淀粉酶耐盐性比对在产酶发酵培养基中分别添加浓度为10%、15%、20%、25%、30%、35% 的 NaCl，并且以不含 NaCl 的发酵培养基作为对照，将其灭菌后，分别接入等量的突变菌株和野生菌株，发酵后测定其酶活，比较野生菌和突变株所产淀粉酶的耐盐能力。

2结果与分析

2.1 产淀粉酶嗜盐菌株分离筛选

根据a平板上菌落生长情况，选出能够生长的44株菌，经过b平板上产淀粉酶筛选，用卢氏碘液染色和c培养基摇瓶发酵测定其淀粉酶活力，获得在pH 7.5时具有产淀粉酶的菌株5株（表1）。其中，NWU-8菌株染色圈直径最大，为2.867 cm，染色圈直径/菌落直径比值最大，为2.182，酶活力最大，说明NWU-8是产淀粉酶能力最强的菌株，挑选其作为本试验的出发菌株进一步研究。

2.2形态学与生理生化鉴定

NWU-8菌株在a平板上形成的菌落呈乳白色，正反面颜色相同，菌落边缘整齐，中间有凸起，表面有皱纹，光学显微镜下观察NWU-8菌株革兰氏染色为阳性，菌体为杆状，有芽孢，直径小于1μm。生理生化反应见表2。

2.3 16S rDNA基因序列分析

提取NWU-8菌株的总DNA进行PCR扩增，凝胶电泳回收扩增序列，得到一段1484 bp长度的16S rDNA，所获序列提交Genbank（Genbank登录号KP729620）进行BLAST分析，通过Mega 5.0软件构建系统发育树。如图1所示，发现NWU-8菌株与Halorubrum sp. YC-16同源性达到100%，由此可将NWU-8 菌株鉴定为 Halorubrum sp.。

2.4诱变育种结果分析

菌株NWU-8经过He-Ne激光诱变之后突变结果如图2所示，对比致死率与正突变率，确定菌株最佳诱变时间为20 min。反复对NWU-8菌株进行激光诱变，将突变株点种到b平板上37℃恒温培养7 d，用卢氏碘液染色。观察菌落的生长情况和菌落直径、染色圈直径的大小，比较染色圈直径/菌落直径的比值。挑取染色圈直径大，染色圈直径/菌落直径比值大的突变株进行液体摇瓶发酵，检测突变株产淀粉酶的能力（表从表3中可以看出，NWU-8-14菌株染色圈直径最大，为3.206 cm，单株菌落直径较大，为1.316 cm，染色圈直径/菌落直径比值最大，为2.436，产酶活力为138 U/mL，与NWU-8菌株相比产酶能力提高331%，对比出发菌株NWU-8，突变株无论是从菌株直径大小、染色圈直径大小、染色圈直径/菌落直径比值以及酶活力都有较大提高，说明高产突变株选育达到了试验目的，可将NWU-8-14菌株作为诱变育种后的高产菌株。

2.5 突变株传代培养检测稳定性

将突变株进行50代传代培养，每隔5代检测1次菌株所产淀粉酶活力，结果见表4。经过50代后，根据单样本检验分析，P均大于0.05，说明各代之间产酶能力无显著差异，表明NWU-8-14菌株的遗传稳定性较好。

2.6突变株所产淀粉酶耐盐性测定将挑选出的突变株NWU-8-14和野生菌株NWU-8分别加入含有不同浓度NaCl的发酵培养基中，检测菌株及所产淀粉酶的耐盐度。35℃，180r/min发酵3 d后测定其酶活力，所得结果如图3所示。由图3可以看到，野生菌NWU-8虽然能够耐受一定浓度的盐分，但当盐浓度升至25%时，所产淀粉酶就几乎没有了活性;而突变株NWU-8-14相对比亲本其耐盐能力有了较大提升，所产淀粉酶一直保持良好的活性，尽管在盐浓度高达35%时，仍旧保持较好的酶活力。

3讨论与结论

研究表明，嗜盐菌所产的酶应具有更广泛的耐盐碱特性，应用范围也更宽泛。其所产的淀粉酶比普通淀粉酶在盐碱环境中具有更好的稳定性。目前，有研究报道证实了此结论，主要为Bacillus subtilis[17]、Haloarcula hispanica[18]、Halobacterium halobium[19]、Halomonias meridiana [20]、B. dipsosauri [21]、B. lichenifor-mis[22]等。

本研究从定边县盐湖的土壤中分离筛选出1株产淀粉酶的噬盐性菌株。经形态、生理生化及分子系统学研究，该菌被鉴定为Halorubrum sp.。为提高该菌株的耐盐性和产淀粉酶的能力，对其进行了He-Ne激光诱变，并选育出一株耐盐性和产酶能力均明显提升的突变株NWU-8-14，该突变株菌株对盐浓度耐受性可达到35%;此外，其产酶活力达到138 U/mL，产酶能力大大提高，且经过50代传代检测，菌株遗传穩定性良好。

参考文献：

[1]毕静，薛茂云，杨爱萍，等.利用枯草芽孢杆菌生产中温淀粉酶发酵条件的优化研究[J].中国调味品，2014， 39（9）： 49-51.

[2]张宁，蒋剑春，李翔宇，等.我国非粮燃料乙醇产业发展现状及前景展望[J].生物质化学工程，2011，45（4）： 47-50.

[3]李欣，张丽萍，程辉彩，等.耐低温兼性厌氧淀粉酶产生菌Y89的筛选及酶学特性[J].中国农学通报，2011，27（7）： 107-111.

[4]张丽靖，沈江锋，金庆超，等.一株酸性淀粉酶产生菌的分离、鉴定及酶学特性初步研究[J].生物技术通报，2011 （5） ： 142-145.

[5]胡建恩，曹茜，杨帆，等.耐高温α-淀粉酶高密度高表达发酵条件的优化[J].食品科学，2012， 33（1）： 219-225.

[6]左雪枝，方华舟.牛粪堆肥中高效菌株的筛选与应用效果[J].中国土壤与肥料，2014（1）： 95-100.

[7]周德庆.微生物学试验手册[M].上海：上海科学技术出版社，1986.

[8] KRIEG R N， HOLT J G. Bergeyp's manual of determinalive bacteri-ology [M ]. Baltimore ： Williams & Wilkins， 1994.

[9]TAMURAK， DUDLEY J， NEIM， et al. MEGA4： Molecular evolu-tionary genetics analysis （MEGA） software version 4.0[J]. Molecu-lar biology and evolution， 2007， 24（8） ： 1596-1599.

[10] 付瑞敏，韩鸿鹏，张丽琴，等.葡萄霜霉病和白粉病拮抗菌的分离、鉴定和He-Ne激光诱变[J].江苏农业科学，2013， 41（8）：122-125.

[11] 郭爱莲，朱宏莉.紫外、氦氖激光等复合诱变产果胶酶细菌ZH-1 的研究[J].光子学报，2002， 31（ 11）： 1335-1339.

[12]巩洁，陈亮，陈立，等.紫外线、He-Ne激光对葡萄白腐病菌拮抗菌PT2的复合诱变效应[J].植物保护，2010， 36（5）：105-109.

[13] PRAKASH B， VIDYASAGAR M， ADHUKUMAR M S， et al. Pro-duction ，purification，and characterization of two extremely halo-tolerant thermostable， and alkali-stahle a-amylases from Chromo-halobaacter sp.Lj J. Process biochemistry， 2009， 44（2）： 210-215.

[14] 宁正祥.食品成分分析手册[M].北京：中国轻工业出版社，1998.

[15]刘贺红，万金泉，马邕文，等.DNS比色法测定污泥中淀粉酶活性的研究[J].安徽农业科学，2008， 36（33） ： 14369-14371.

[16] 张继千，吴波，郑冰心，等.海洋菌W11产中温淀粉酶的酶学特性[J].基因组学与应用生物学，2010， 29 （1）： 71-74.

[17] YANDRI S T， HADI S. Purification and characterization of extra-cellular a -amylase enzyme from locale bacteria isolale Bacillussubtilis ITBCCB148[J]. Eur J Sci Res， 2010， 39 （1） ： 64-74.

[18]HUTCHEON G W， VASISHT N， BOLHUIS A. Characterizationof a highly stable α-amylase from the halophilic archaeon Haloar-cula hispanica [J]. Extremophiles，2005， 9 （6）： 487-495.

[19] PATEL S， JAIN N， MADAMWAR D. Production of α-amylasefrom Halobacterium halobium [J]. World journal of microbiology &biotechnology， 1993， 9 （ 1） ：25-28.

[20] CORONADO M J， VARGAS C， HOFEMEISTER J，et al. Produc-tion and biochemical characterization of an α-amylase from themoderate halophile Halomonas meridiana [J]. FEMS microbiologyletters， 2000，183 （l）： 67-71.

[21] DEUTCH C E. Characterization of a salt tolerant extracellular a-amylase from Bacillus dipsosauri [J]. Lett Appl Microhiol，2002，35 （1）： 78-84.

[22] MACHIUS M， WIEGAND G， HUBER R. Crystal structure of calci-um depleled Bacillus licheniformis α-amylase al 2.2 A resolution [J].Journal of molecular biology， 1995，246 （4）：545-559.

收稿日期：2019-11-10

基金项目：甘肃省高等学校创新能力提升项目（2019B-203）

作者简介：张伟（1984-），男，甘肃慶阳人，讲师，主要从事微生物物种资源研究，（电话）18293373738（电子信箱）274591224@qq.com;通信作者，周晓伦，讲师，主要从事土壤微生物研究，（电子信箱）610253095@qq.com。