CXCL6基因在大鼠睾丸组织发育过程中的表达*

云 霞 陈 琪 周好乐 杨 铮 塔 娜 于泊洋 张 岩 张信来 刘陶迪**

1.内蒙古医科大学基础医学院（内蒙古呼和浩特010059）；2.内蒙古医科大学附属医院

哺乳动物青春期后睾丸开始发育，生精细胞增殖分化，启动生精过程。据世界卫生组织估计，10%的已婚夫妇患有不育症,其中男性因素约占30-50%[1]。男性不育症是人类生殖研究的重要课题。导致男性不育的原因复杂，其中精子发生过程中，由诸多基因参与的调控机制异常是重要的因素[2，3]。随着分子生物学技术的发展与广泛应用，揭示精子发生的分子调控机制已经成为男性不育研究领域的热点。

CXCL6(C-X-C motif ligand 6)又名粒细胞趋化蛋白 -2(granulocyte chemotactic protein-2,GCP-2)，最初在骨肉瘤细胞株上被发现，是趋化因子的重要成员。研究表明CXCL6具有趋化粒细胞、参与炎症反应，调节免疫应答的作用[4]。此外CXCL6促进血管生成，与肿瘤的生长和转移有关[5]。在生殖医学领域，雌性子宫中的研究当中发现，CXCL6与羊膜腔中的免疫反应以及抑制滋养层细胞的移行和入侵有关[6，7]。本实验检测CXCL6基因在2～65日龄大鼠睾丸组织中的表达,进一步探讨CXCL6基因在精子发生过程中的作用。

材料与方法

一、材料

（一）实验动物

将购自内蒙古大学实验动物中心，清洁级，10周龄左右的Wistar大鼠在内蒙古医科大学动物中心饲养。将一只雄性和两只雌性鼠合笼,自然交配,保证充足的饲料和干净的饮水供给，每周换垫料，第8天后分笼。每日观察雌鼠3次,将出生当天的鼠，计数为第1天，即1日龄，编号饲养。将2～65日龄，21个不同时间节点，每个时间节点3只不同窝别的，总计63只雄性Wistar大鼠颈椎脱臼法处死后，取下睾丸组织，-80℃冰箱储存备用。

（二）实验试剂

总RNA提取试剂盒(DP419)购自天根生化科技有限公司。反转录及实时定量PCR（RT-PCR），使用SYBR Prelnix Ex TaqTM试剂盒，购自大连宝生物公司。引物由上海生物工程公司合成提供。免疫组织化学染色使用UltraSensitiveTMS-P超敏试剂盒（鼠/兔）(福州迈新生物技术开发有限公司，Kit-9710)，用DAB显色试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司，Kit-0014）显色。 兔抗大鼠 CXCL6（GCP-2）抗体（JM7139）购于北京嘉美生物技术有限公司。HRP标记的羊抗小鼠IgG购于Abcam公司。

二、实验方法

（一）总RNA提取

取各时间节点的50mg睾丸组织，按照总RNA提取试剂盒说明书操作步骤，提取总RNA。用紫外分光光度仪测定RNA浓度和纯度。RNA浓度测定3次，取平均值。RNA纯度以A260/A280比值在1.95～2.10之间为合格。总RNA提取物管-80℃冰箱保存。

（二）RNA反转录为cDNA

根据各样品总RNA的浓度和纯度值，将样品制成体积 30μl，浓度为 0.2μg／μl的稀释液，制作转录体系A液和B液。A液10μl，包括样本总RNA 4.0μl，Oligo-dt(10umol/L)1.0μl，加入 RNase-Free dH2O 至 10μl。B 液 l0μl， 包 括 5 ×M-MLVbuffer 4.0μl，dNTP Mixture(10mmol/L)2.0μl，RNase Inhibiter(40U/μl)1.0μl，M-LV Reverse Transcriptase (5U/μl)0.5μl，RNase-Free H2O 2.5μl。按照说明书操作步骤，混合A液与B液，制备成20μl反应体系，42℃水浴60分钟，72℃水浴10分钟进行mRNA反转录反应。反转录成的cDNA-20℃冰箱保存。

表1 CXCL6基因引物列表

（三）Real-time PCR

使用SYBR Prelnix Ex TaqTM试剂盒进行，以cDNA样本为模版对CXCL6基因进行Real-time PCR反应。CXCL6基因引物通过Primer5软件设计（表1）。根据试剂盒说明及引物的条件设定RT-PCR的反应程序为： 预变性 95°C 10 min;95°C 30s；95°C 5s；55°C 30s；72°C 34s，扩增40个循环。反应体系模版分别来自三组不 同 窝 别 出 生 2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65 日龄的 21 个时间节点的大鼠睾丸组织cDNA。每个时间节点的样品重复检测两管，以GAPDH做为内参对照，以H2O做为阴性对照。用Ct方法分析CXCL6 mRNA的表达量，结果用基因mRNA相对表达倍数表示。计算方法用2-ΔΔCt法，数据和图表使用Microsoft Excel分析。

（四）免疫组织化学染色

取65日龄大鼠的睾丸组织石蜡切片,烤片、脱蜡水化。PBS洗三次，每次5min，微波15 min进行组织抗原修复。切片滴加过氧化酶抑制剂室温处理10 min之后PBS洗三次，每次3min。滴加兔抗大鼠CXCL6（GCP-2）抗体（1：80），湿盒中 4℃过夜，以 PBS 替代一抗做为空白阴性对照。次日，PBS洗三次，每次3min，滴加HRP-羊抗小鼠／兔IgG,室温孵育10min。PBS淋洗后，滴加H2O2-DAB显色，苏木素复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明后封片。在显微镜下观察，拍照。

结 果

一、Real-time PCR检测CXCL6基因表达

引物的溶解曲线重合度高，可知其特异性好（图1 A，C），扩增曲线在PCR平台期几乎重合（图1 B，D）。

图1 CXCL6和Gapdh的基因扩增熔解曲线与扩增曲线

通过Real-time PCR反应检测三组不同窝别来源，出 生 2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65 日龄，21 个不同时间节点的大鼠睾丸组织中的CXCL6基因表达。三组不同窝别来源的大鼠睾丸组织中，CXCL6 mRNA水平表达变化趋势基本相同，在大鼠出生的第2到65天呈动态变化。

CXCL6 mRNA表达在出生后第2天呈高表达，随后开始迅速下降，在第8天下降到最低值，并且一直持续到第16天。从第20天起迅速线性升高表达，在第29天时达到整个发育过程的最高值，之后开始下降。第35天起CXCL6基因的表达再次呈现升高趋势，在第45天形成一个小高峰表达之后，维持一定的表达量持续至第 65 天（图 2）。

图2 CXCL6基因在3组不同窝别出生2至65日龄大鼠睾丸组织中mRNA的相对表达量

图3 65日龄大鼠睾丸组织免疫组织化学染色

二、免疫组织化学染色检测CXCL6蛋白在65日龄大鼠睾丸组织中的表达

65日龄大鼠睾丸组织免疫组织化学染色显示，曲细精管内可见CXCL6蛋白阳性表达的细胞。在精母细胞边缘和圆形精子以及曲细精管管腔的成熟精子处均呈现阳性信号（图3）。

讨 论

睾丸的曲细精管是精子生成的场所。精子发生包括精原干细胞的增殖与分化，减数分裂和成熟精子形成等三个阶段[8]。每个阶段都是多基因参与的复杂的调控过程。Wrobel G等[9]研究表明，大鼠出生后1-8天以精原干细胞的自我增殖和分化为主；出生后14天左右开始减数分裂，出现初级精母细胞；出生20天之后进入圆形精子发生阶段，此时第二次减数分裂完成，圆形精子首次出现；出生35天后完成圆形精子向长形精子的变形，形成成熟的精子；出生56天后大鼠性成熟，达到成年状态[10]。

本研究对大鼠出生后第 2、4、6、8、10、12、14、15、16、20、25、29、30、31、35、40、45、50、55、60、65 天的睾丸组织进行CXCL6基因表达检测。观察到CXCL6基因在大鼠精子发生过程中，转录水平表达呈动态变化。在大鼠出生后第2天CXCL6基因mRNA呈高表达，随后迅速下降，在第8天下降到最低值，一直持续到第16天。根据Wrobel G等和刘陶迪[11]等的研究结果，该时期是大鼠精原干细胞增殖分化的关键时期，推测CXCL6基因可能通过调低表达，参与精原干细胞的增殖过程。

从第20天起CXCL6基因表达量迅速线性升高，在第29天时可达到整个发育过程的最高值，之后开始下降。研究表明大鼠出生20天之后进入圆形精子发生阶段，此时第二次减数分裂刚完成，圆形精子首次出现[12]。第20天后CXCL6 mRNA水平升高，提示减数分裂以后，CXCL6可能通过高表达参与与圆形精子的形成。从第35天到大鼠性成熟，圆形精子细胞核发生聚缩和塑性，经过复杂的变态发育，向长形精子变形，形成成熟的精子。第35天可见CXCL6基因的表达再次呈现升高趋势，在第45天形成一个小高峰之后，维持一定的表达量持续至第65天。由此推测CXCL6基因可能与圆形精子细胞变态转变为长形精子以及长形精子的成熟有关。65日龄大鼠睾丸组织免疫组织化学染色显示曲细精管内可见CXCL6蛋白阳性表达的细胞。CXCL6蛋白位于精母细胞边缘和圆形精子处，提示CXCL6在减数分裂后期表达，支持该基因参与圆形精子形成的推断。CXCL6蛋白在长形精子处表达也提示CXCL6基因在长形精子成熟的过程中发挥重要的作用。

临床研究提示男性生殖能力降低与顶体发生及顶体反应异常有关[13]。 田洪艳[14]等报道，圆形精子细胞期是顶体发生的重要时期，此期内圆形精子细胞核变形的同时，顶体从无到有，逐渐变大，从圆形变成帽形，经历复杂的演变，形成正常结构和功能的顶体。顶体伴随着精子形成过程，也对精子形成过程发挥重要的作用[15]。本研究发现CXCL6阳性信号表达部位与顶体发生的部位相似[16]。实时定量PCR检测结果也支持CXCL6基因在减数分裂之后圆形精子形成阶段升高表达，可达到整个精子发生过程的最高峰值，提示CXCL6基因可能通过与顶体形成相关，对精子形成产生影响，具体的作用机制有待进一步研究。

综上所述，本研究认为CXCL6基因可能参与精原干细胞的增殖；可能与顶体形成相关，在圆形精子的形成以及精子成熟的过程中发挥作用，可能是大鼠精子发生过程，分子调控机制中的重要环节，为揭示该基因男性生殖相关的作用提供了初步的线索。