特发性膜性肾病相关诊断生物标志物的研究进展

杜秀日 林栩

[专家介绍]林栩，教授、主任医师，博士研究生导师，临床肾脏病学专家。现任右江民族医学院附属医院党委书记。主要从事肾小球疾病基础与临床相关研究，现为广西医学会肾脏病学分会副主任委员、广西血液净化质控中心副主任。共发表学术论文80余篇（SCI收录4篇）。主持国家自然科学基金1项、广西自然科学基金4项。2014年获广西科学技术进步奖三等奖1项，2014年和2016年分别获得广西卫生适宜技术推广奖二等奖和三等奖各1项。主编《肾病临床诊治技巧》《现代实用临床肾病学》《肾脏疾病临床诊治及血液净化技术》等专著，参与《内科学》（全国普通高等教育临床医学专业“5+3”教材）编著。

【摘要】 特发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）是目前导致成人肾病综合征的主要病因，发病率逐年上升。IMN的发病机制复杂，病程迁徙，反复发作，可发展为终末期肾脏病，早期发现和干预治疗是改善患者预后的关键措施。近年来国内外学者对IMN相关诊断生物标志物的研究取得了重大进展，这对疾病的早期诊断有重要意义。

【关键词】 特发性膜性肾病;诊断生物标志物;抗原抗体;蛋白质;转录物;代谢物;免疫细胞

中图分类号：R692.9 文献标志码：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.09.001

【Abstract】 Idiopathic membranous nephropathy （IMN） is the main cause of adult nephrotic syndrome，and the incidence rate is increasing year by year.The pathogenesis of IMN is complex，and the course of disease repeatedly migrates，and it can develop into end-stage renal disease.Therefore，early detection and intervention are the key measures to improve the prognosis of patients.In recent years，domestic and foreign scholars have made significant progress in the research of IMN-related diagnostic biomarkers，which is of great significance for the early diagnosis of diseases.

【Key words】 IMN;diagnostic biomarkers;antigen antibody;protein;transcripts;metabolite;immune cells

特發性膜性肾病（idiopathic membranous nephropathy，IMN）是一种自身免疫介导性疾病，该病在我国以13%的发病幅度逐年升高[1]。IMN患者临床表现以肾病综合征为主，余为无症状性蛋白尿，若未经干预则30%～40%的患者5～10年内可进展为终末期肾脏病（end stage renal disease，ESRD）[2]。因此，及早进行诊治，对改善IMN患者预后、降低病死率等都有着巨大的意义。长期以来，诊断IMN很大程度上依赖肾活检穿刺检查，但其有出血、感染等潜在并发症风险，且禁忌于孤立肾、明显凝血功能障碍等患者，反复肾活检可能性不大，可见积极寻找敏感和特异的实验室生物标志物对诊断IMN意义重大。现就IMN相关的诊断生物标志物研究进展进行综述。

1 抗原抗体生物标志物

目前认为补体介导免疫反应引起的足细胞损伤是IMN的主要发病机制。循环自身抗体识别肾小球足细胞上的靶抗原后，与其结合形成循环或原位免疫复合物，沉积在上皮细胞下。经过累积的免疫复合物可激活足细胞表面补体，破坏足细胞结构从而产生蛋白尿[3]。因此，对患者进行足细胞靶抗原及其抗体的检测将为IMN的诊断提供可靠的思路。

1.1 抗M型磷脂酶A2受体（PLA2R）

PLA2R是一种相对分子量为185 kDa的Ⅰ型跨膜糖蛋白，主要表达于人肾小球足细胞。约70%的IMN患者具有针对PLA2R的循环自身抗体[4]，该抗体被认为是IMN的敏感和特异性生物标志物，目前已被广泛应用于临床实践中。研究发现，通过对血清和尿液进行抗PLA2R水平的检测，不仅有助于膜性肾病（MN）的临床诊断，而且对疾病进展、预后转归、治疗均具有重要意义[5～6]。

1.2 抗1 型血小板反应蛋白 7A 域（THSD7A）

THSD7A 是相对分子量约250 kDa的膜结合蛋白，主要分布于肾小球足细胞基底面、足细胞内吞室、足突和裂隙膜[7]，是IMN 发病的第二靶抗原。作为针对该抗原的特异性抗体，抗THSD7A主要存在于PLA2R抗体呈阴性的IMN患者中，可作为该类患者敏感和特异的诊断生物标志物[8]，且抗THSD7A滴度水平与疾病活动和对治疗的反应相关[9]，对IMN的进展和治疗期的监测具有重要意义，但其检出率不高。在一项对578 名中国IMN患者的大批队列研究中[10]，仅8例患者血清检测到抗THSD7A，进一步验证了其检出率较低的临床特点，具体作用机制还有待进一步深入研究。

1.3 抗 Nel样分子Ⅰ型（NELL-1）

NELL-1是一种外分泌型糖蛋白，可在人类胚胎肾细胞中表达，充当细胞外基质成分[11]。SETHI等[12]最新研究发现，NELL-1在经肾脏活检明确的PLA2R阴性MN患者血清和肾小球中过表达，IF共聚焦显微镜显示NELL-1和IgG共定位于肾小球基底膜，同时检测到NELL-1循环抗体的存在，表明 NELL-1可能是IgG的靶抗原，并由此推测NELL-1和抗NELL-1与MN密切相关。尽管NELL-1超微结构足细胞的定位以及抗NELL-1在足细胞黏附和缝隙隔膜稳定中的潜在作用尚未确定，但NELL-1和抗NELL-1的发现为原发性 MN的诊断和研究指明了新的方向。

1.4 抗中性肽链内切酶（NEP）

NEP是一种能够消化具有生物活性肽的膜结合酶，是第一个发现的足细胞抗原。胎儿足细胞上该抗原能够结合抗NEP抗体（IgG4或IgG1，由NEP缺陷的妊娠母体产生后通过胎盘进入胎儿体内）形成免疫复合物，进一步激发补体介导的免疫反应引起新生儿MN[13]。通过检测尿液中的抗NEP和NEP能够确定存在抗NEP导致的同种免疫产前MN风险的家庭，且抗NEP IgG1比抗NEP IgG4 在该病的发生、发展中发挥着更为重要的作用[14]。

2 蛋白质生物标志物

患者尿液中的异常蛋白质能够反映肾脏内发生的多种病理过程，可能是肾脏疾病的潜在非侵入性生物标志物。近年来在IMN患者中检测到的新型尿蛋白候选物为IMN的诊断开拓了新的领域。

2.1 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）

NGAL是一种在中性粒细胞及炎症状态的上皮细胞（包括肾小管上皮）表达的小分子蛋白。与健康对照组相比，IMN患者尿NGAL排泄率升高，且与蛋白尿和肾小球滤过率（eGFR）显著相关，能够反映肾小管损伤的严重性，可作为IMN中肾小管损伤的尿标记物[15]。此外，其在IMN早期阶段可能存在预后价值，但当与已建立的标志物如α-1-微球蛋白或β-2-微球蛋白比较或组合时，不能提高预后准确性[16]。

2.2 足细胞糖萼蛋白（PCX）

PCX是一种位于足细胞顶表面，有着维持足细胞的形状和裂隙膜作用的跨膜蛋白。IMAIZUMI等[17]使用蛋白质印迹和ELISA发现MN患者尿液PCX（u-PCX）水平上升，随后通过构建基于u-PCX和临床参数（包括年龄、eGFR和糖尿病病史等）的组合模型，证明u-PCX可作为MN的诊断标志物和该诊断模型在抗PLA2R敏感性较低的群体（如日本）中的临床实用性。通过验证，该诊断模型灵敏度为80.5%，特异性为截止值的73.5%。

2.3 α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）

A1AT是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在先前的研究中被认为是足细胞应激的标志之一，与局灶性节段性肾小球硬化（FSGS）的发展有关[18]。PANG等[19]使用串联质谱标签（TMT）技术结合纳米级液相色谱串联质谱分析（LC-MS/MS）对原发性膜性肾病（PMN）患者进行尿液蛋白质组学研究发现A1AT表达上调，并通过Western blot验证了其过表达的有效性。在该研究中，PANG等认为 A1AT主要是参与免疫应答和凝血级联反应，在PMN的发病机理中发挥作用并可作为PMN候选生物标志物。

3 转录物生物标志物

转录组是由信使RNA（mRNA）、转运RNA（tRNA）、核糖体RNA（rRNA）和其他的调节非编码RNAs组成的一系列RNA分子。在肾脏疾病的研究中，通过定量实时聚合酶链反应和基因测序等技术对转录物的分析可为疾病的遗传学研究提供重要信息，对疾病的诊断有着不可或缺的意义。

3.1 主要组织相容性复合体-I类分子-C（HLA-C）和铁蛋白重链（FTH1）

HLA-C是人类白细胞抗原的一个基因座，主要参与外源抗原向免疫系统的表达。FTH1则是一种重亚基铁蛋白编码基因，能保护近端肾小管上皮细胞和肾脏免受活性氧生成过程中游离铁活性的影响[20]。WAN等[21]对IMN和健康对照组患者的外周血细胞进行了RNA-seq测序，发现HLA-C基因表达上调，FTH1表达下调，同时用qRT-PCR进行了验证，结果表明HLA-C及FTH1与IMN相关的可能性很高，对IMN有潜在的临床诊断价值。然而，它们在IMN患者血清中的水平及具体的发病机制需继续深入探究阐明。

3.2 黏蛋白3A（MUC3A）基因

MUC3A是一种膜相关黏蛋白，有证据显示其与局部透明细胞肾细胞癌的预后不良有关[22]，但尚未发现在其他肾脏疾病中报道。MA等[23]对IMN患者血清和尿液外泌体进行circRNA基因测序的研究发现MUC3A基因表达上调并认为其可能是一种潜在的IMN诊断生物标志物。IMN发病过程中的主要补体激活途径是甘露糖结合凝集素通路，而MUC3A基因编码的大部分氨基酸是丝氨酸/苏氨酸[4，24]，因此MUC3A基因可能编码相关的氨基酸，进而通过甘露糖结合凝集素途径在IMN的发病过程中发挥重要作用。

3.3 miR-193a

miRNA是一种参与转录后基因沉默的非编码RNA，近年来逐渐在肾脏疾病中检测到并可作为潜在的非侵入性诊断生物标志物。ZHANG等[25]通过RT-PCR检测发现miR-193a在IMN患者尿液中高表达，且随IMN严重程度的增加而明显升高，可见其能够提示IMN活动的进展。此研究中他们还发现IMN患者组织中Wilms肿瘤1型足细胞 （WT1）/尿液中足细胞裂解素（PODXL）表达下调，并推测miR-193a与WT1和PODXL的组合可能是评估IMN发病和预后的理想方法，且這种联合诊断还能够区分IMN患者在各个阶段的预后。

4 代谢物生物标志物

代谢物是可通过核磁共振（NMR）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）、液相色谱-质谱联用（LC-MS）等代谢组学技术检测的小分子化合物，与疾病表型的相关性更高[26]。尿代谢物反映了肾脏受损分子水平，对MN患者尿代谢物的检测有助于了解潜在的生物标志物和致病机制。

4.1 肌肽

肌肽是一种天然的活性氧（ROS）清除剂，具有肾脏保护作用[27]。2018年TAHERKHANI等[28]使用质子核磁共振（1 H-NMR） 和GC-MS技术分析了原发性膜性肾小球肾炎（MGN）患者和健康志愿者的尿液代谢产物，并通过构建MGN相关的代谢网络，鉴定了包括肌肽在内的13种差异代谢产物，推测它们是MGN的潜在诊断生物标志物。该实验中，与健康对照组相比，MGN患者的尿肌肽增加，TAHERKHANI等认为是肾脏组织中ROS水平升高所致。肌肽具有抗氧化、抗炎、抗糖化等特性，可参与肾脏中的不同代谢途径，而慢性肾脏病会发生氧代谢异常[29～30]，不排除肌肽水平的升高是通过一种适应性机制来抵消MGN中炎症和氧化应激的增加，可见进一步研究其在MN中的作用可能为疾病的诊断和治疗提供创新和有效的策略。

4.2 煙酰胺

烟酰胺是一种具有生物活性的维生素B3吡啶衍生物，研究指出其参与合成的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氢-氧化酶复合4（NOX4）可能通过诱导氧化应激和线粒体异常引起早期多囊肾疾病[31]。结合NMR和气相色谱-串联质谱（GC-MS/MS）对MGN患者进行尿代谢组学分析后，TAHERKHANI等[32]发现尿液中烟酰胺含量表达降低，认为其可以作为MGN潜在生物标志物，但单个生物标志物可能对诊断不具有足够的敏感性和特异性。此外，研究中还发现氮源（尿囊酸）、嘧啶代谢成分和DNA成分（脱氧尿苷）、燃料和能量储存（5a-胆甾酮、L-棕榈酰肉碱、表观甾醇和棕榈酸）等尿代谢产物均可能对MGN的诊断有一定的帮助。

5 免疫细胞生物标志物

IMN被认为是一种特异性自身免疫性疾病，因此评估免疫细胞可能是一个很好的疾病诊断工具，但是目前针对IMN免疫细胞的诊断研究较少，多为评估IMN病情进展或研究治疗效果。

5.1 ICOS+ 滤泡辅助性T（Tfh）细胞和PD-1+ Tfh细胞

Tfh是一种独立的CD4+效应细胞亚群，主要功能是辅助B细胞增殖和参与体液免疫。ICOS+和PD-1+是Tfh细胞表达的两个主要细胞外标志物。SHI等[33]在IMN患者外周血细胞中，观察到高比例的ICOS+/PD-1+ Tfh细胞以及IL-21+Tfh细胞（Tfh细胞中的IL-21）水平上调，这两个参数与IMN患者的24小时尿蛋白呈正相关，表明它们可能是判断IMN发展的潜在生物标志物，但其诊断价值需进一步研究评估。

5.2 CD14+ CD163+ CD206+ M2样单核细胞

M2单核细胞是一种可以分泌IL-10等抗炎介质以触发Th2免疫反应的细胞， HOU等[34]发现，IMN早期患者外周血循环中的CD14+ CD163+ CD206+ M2样单核细胞计数升高，并和细胞内IL-10浓度、蛋白尿及血清PLA2R值呈正相关，可见该细胞具有对IMN严重程度的评估作用及在早期IMN病理过程的潜在作用。

6 小结与展望

IMN是肾病综合征的主要病理类型之一，也是ERSD的主要原因，对患者经济及医疗保健系统增加了巨大负担。目前肾活检是诊断IMN的金标准，由于其侵入性的限制使探索新型的诊断生物标志物成为诊断IMN的一个热点。除抗PLA2R和抗THSD7A外，上述基于抗原抗体、蛋白组学等IMN相关诊断生物标志物尚未得到充分验证，仍需要进一步深入研究来证实其作为日常实践中诊断IMN的临床应用价值。

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（收稿日期：2020-04-14 修回日期：2020-05-17）

（編辑：梁明佩）