肝脏组织的相位衬度成像实验研究

刘安娜 苏 雅 马紫瑶 房 蕾 彭屹峰* 肖体乔 杜国浩 何 伟

光是一种兼具波和粒子二相特性的物质现象。光子密度决定光的强度，光波和光子的关系是光波振幅平方和光子密度成正比；频率一致的光称为相干光，相干光相遇即相干迭加或干涉。X射线也是一种光，当X射线穿过物质并与物质发生作用后，其折射率可以写成n=1-δ-iβ[1]，其中β为吸收项，δ为相位项，理论上在医学诊断使用能段范围，相位项比吸收项大1000多倍，因此在吸收衬度很难探测的情况下仍有可能观察到相位的衬度。传统X射线成像混有折射和散射信息，因而降低了成像的分辨率和衬度。相位衬度成像(phase contrast imaging， PCI) 则利用X射线透过样品后携带的相位信息对样品内部结构进行成像，克服了传统成象方法的不足。适用于相衬成像技术常见的有：类同轴成像（1995年发现）、衍射增强成像 (diffraction enhanced imaging， DE；1995年发现)、干涉法成像（1971年发现）以及光栅成像技术四种（2002年发现）[2-4]。

1.类同轴成像方法

主要原理是：在类同轴成像中，均匀的相干光波通过界面非均匀的物体，光的强度不发生变化而波前将发生畸变，继续传播到一定的距离，将和未发生畸变的波面重叠而发生干涉，这样X射线通过物体后，传播一定的距离就能将相位信息转化为强度变化，即菲涅耳衍射成像-相位二阶导数衬度成像，因此可见相位变化。类同轴方法具有大视野、高通量和实时成像的优势[5-7]。而且获得的图像和目前的临床的X线图像相似，因此容易解释[8]。

2.衍射增强成像（DEI）原理[9]

X射线与物质作用后，会发生吸收、折射和散射，其中折射和散射光的出射方向会偏离入射方向，而DEI最重要的是使用分析晶体将透射、折射和散射光对成像的作用分离，并将小角散射滤除，因此可以大大提高成像的衬度和空间分辨率。

3.干涉法成像

由Momose和Takeda首先引入成像研究[10-12]。干涉法成像是发现软组织内微小折射指数差异的最为敏感的方法，但由于需要精密复杂的干涉仪，且干涉仪晶体准直度和机械稳定性要求高，加上受到晶体尺寸和成像视野的限制，其应用受到局限[13]。

4.光栅成像

光栅成像是利用光栅干涉仪将由样品引起的入射波前畸变信息转化为莫尔条纹的畸变，应用相阶方法(phase stepping)采集数据，再通过探测器(CCD)记录莫尔条纹[14]，对不同图像的同一像素点进行正弦曲线拟合，从而获得成像结果。光栅成像可以得到更好的成像结果和更加丰富的样品信息，并且将会在生物医学领域发挥更好的作用。

同步辐射(synchrotron radiation ，SR)是速度接近光速的带电粒子在作曲线运动时沿轨道切线方向发出的电磁辐射。由于同步辐射光的相干特性，适用于进行相干衬度成像应用。目前国际上大多数的同步辐射装置都有光束线开展相衬成象研究。

本实验旨在应用同步辐射光源进行大鼠肝脏的成像实验，通过4种不同的相位衬度成像方法对大鼠肝脏的成像比较研究，以分辨率和衬度作为主要评估标准，探索相位衬度技术在肝脏组织上的成像价值及在临床应用上的前景。

方 法

根据不同的成像方法成像光路有不同设计，其中类同轴成像光路设计最为简单，仅须调节物像间有效距离到成像最佳位置（图1）。而衍射增强成像则是在样品后方添加一块分析晶体（图2），以获得摇摆曲线（rocking curve， 衍射强度随角度的变化曲线），一般选择在峰位和侧位不同位置，曝光时间5～10秒（以总曝光量达到饱和曝光量的75%为宜，与扫描位置、光束能量的实际值有关）。干涉法成像是在是在样品后方置放由一整块硅单晶分割成平行放置的三块晶体完美晶体（图3）。光栅成像是在样品后方与探测器之间置放一块自成像光栅和分析光栅（图4）。干涉法和光栅成像均不断调节晶体位置最后获得较为清晰的成像效果为止。

X射线能量范围主要分布在3～22keV，实验采用12keV。将4只SD大鼠处死后，取出肝脏，经福尔马林固定后置于样品架上。

探测器使用X射线电荷耦合器件（charge couple device， CCD）成像系统采集图像。图像的评价（血管直径的测量）所获得的图像通过实物显微放大的方法可以测定其分辨率。

结 果

在上述4种方法获得的图像均可以显示肝脏的8级分支，血管的直径从主干到外周分支逐渐变细，测量到的最细血管直径大约30μm，所获得的图像具有

图1 类同轴成像方法，通过调节物-像之间距离获得最佳成像效果。图2 衍射增强成像（DEI），通过晶体获得入射与折射之间的曲线关系再获得成像。图3 干涉法成像，通过调节晶体间关系获得成像。图4 光栅成像，利用利用两块光栅形成的角分辨能力，将样品的折射角信号转换成图像信息。

图5 4种不同相位技术获得的成像结果。A.类同轴相衬像；B.光栅微分像；C.衍射增强折射像；D.干涉条纹像。

图6 类同轴成像与病理结果对照及组织学示意图对照，证实与病理结果及组织学具有一致性。

很高的衬度和空间分辨率，特别是在放大的图像上观察的更清晰。肝脏血管的显示对疾病的诊断和治疗都有意义，在肝癌患者中，微血管密度与患者术后生存相关。目前在临床可以通过观察微小血管密度（MVD）等判断抗肿瘤新生血管治疗的疗效，但分辨率都不够。

另外，通过肝脏的类同轴成像效果与病理结果对照及组织学示意图对照，证实与组织切片具有一致性：血管、胆管明显显示，肝小叶结构清晰显示， 包括小叶间结构及窦状间隙血管。肝细胞在围绕窦状间隙中呈板状排列。肝小叶（hepatic lobule）是肝的基本结构单位，呈多角棱柱体，长约2mm，宽约1mm，成人肝脏有50万～100万个肝小叶。肝小叶中央有一条沿其长轴走行的中央静脉（central vein），肝索和肝血窦以中央静脉为中心向周围呈放射状排列。肝脏细胞直径约15～30μm。肝小叶作为肝脏的解剖功能的基本单位，几乎所有的肝脏疾病都能引起肝脏微细结构的改变，如肝纤维化是肝硬化和肝癌的主要原因，由于肝脏疾病导致肝脏小叶脉管系统的紊乱。小叶微细结构的变化对于病变的诊断和评价特别重要。而相位衬度成像方法可望将肝小叶病理学损伤的病因及发展规律进行可视化显示。

讨 论

常规的X线成像只利用了光波在穿透物质时其振幅的改变，而相位衬度成像则是基于利用光波的相位变化。研究表明，当光波穿透物质时，其相位随密度变化的衬度比相应吸收变化的衬度要高得多，因此，利用相位衬度信息有可能获得更清晰的成像效果。

与常规医用检查比较，同步辐射在肝脏组织成像中的主要优势为可在宽能范围内发出极高通量的单色准直X射线束。理论依据包括：同步辐射X线的高亮度特性。同步辐射的相干性特性可以进行肝脏组织的相位衬度成像。同步辐射相位成像技术空间分辨率可得到明显提高，可达到微米（μm）量级，可以显示包括胆管、中央静脉在内的肝小叶结构。

肝脏的基本功能和结构单位是肝小叶，从上述图像所显示的大鼠肝脏切片的结构和分辨率结构来看，这种相位成像方法中可以清晰显示肝脏小叶结构，基于对功能单位的早期显示，如有相应尺寸光斑的光源，有望应用于肝脏病变的早期诊断。

上述各种方法中对于微小血管的显示都较为清晰，分辨率可达到微米量级，在乳腺癌、肝癌、胃癌的成像中都获得较好的显示。李瑞敏等[15]在利用同步辐射类同轴相衬技术对人乳腺癌标本进行成像，观察乳腺癌肿瘤新生血管的形态和分布。在不应用对比剂的情况下成功获得微米级的乳腺肿瘤新生血管，能清晰显示最小直径约9μm的肿瘤血管。这个研究选取的是临床上新鲜的乳腺癌标本，手术取出后立即放入甲醛溶液中固定，保证了肿瘤血管内的血液能及时固定下来而不会被其他物质影响，从而真实反映肿瘤新生血管的状态。这样做其中最大的一个优势为在无对比剂情况下即可实现肿瘤新生血管的成像，避免使用碘对比剂带来的各种不良反应，为以后临床不用对比剂即可进行血管成像提供了一定的思路。肝细胞癌(HCC)是我国常见的恶性肿瘤，其发病率和病死率均位列恶性肿瘤第2位。HCC是典型的多血管恶性肿瘤，肿瘤细胞的无节制性生长和远处转移都是建立在肿瘤新生血管形成的基础上的。因此，早期显示这些微血管的改变，对HCC的早期诊断和治疗都具有重要临床意义。李蓓蕾等[16]利用同步辐射衍射增强成像技术（DEI）对离体人肝细胞癌(HCC)新生血管做了研究，结果在DEI成像结果中，我们可以看到肿瘤呈膨胀性生长，边界清晰，肿瘤边缘或周围可见较粗大的血管受压呈弧形移位；瘤内微小血管较丰富，分布杂乱无章，形态无规则，测得的最细血管直径约为25μm。在摇摆曲线不同位置记录的HCC图像的差异显著。总之，该研究通过同步辐射DEI技术进行无对比剂条件下离体人HCC 标本肿瘤新生血管显像，获得了较满意的图像。林慧敏等[17]通过动物样品的光栅X 线相衬成像法，结合常规HE 染色结果，研究光栅成像在无对比剂情况下对肿瘤及内部新生血管微结构进行成像的价值。最后在无对比剂的情况下，第三代同步辐射光栅X线相衬技术能对胃癌肺转移灶及血管结构进行清晰成像，显示血管直径达到15～30μm，近似低倍光学显微镜下的图像，说明光栅X线相衬成像对显示裸鼠胃癌肺转移灶中的新生血管具有较高应用价值。