抑制SGLT对软脂酸诱导的内皮细胞损伤影响研究

李春盈 苏悦 陈霞 何航辉 郑超

糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，可出现系统性炎症反应和氧化应激损伤，导致大血管和微血管病变[1-2]。糖尿病患者发生血管病变时血管内皮结构和功能严重受损，而这种改变又是多种心血管疾病的始动因素和中心环节[3-4]。钠葡萄糖共转运体（sodium/glucose cotransporter，SGLT）抑制剂上市后，临床发现其在减弱心血管疾病危险因素和降低全因死亡率上都有明显的优势[5]，但相关的基础研究较少，作用机制不明。SGLT2是转运葡萄糖的主要载体，存在于肾小管上皮细胞，位于近端S小管的1片段，对葡萄糖的重吸收作用占90%；而SGLT1出现在近曲小管更远端的S3段[6]，近来发现SGLT1在心脏组织也呈现高表达状态[7]。临床研究表明SGLT抑制剂能够明显提高机体对胰岛素的敏感性，降低血压、体重和尿酸，对心血管系统起保护作用[8]。而胰岛素对血管内皮细胞发挥生物学效应是通过与胰岛素受体结合产生的，胰岛素与其受体结合后相继激活胰岛素受体底物（insulin receptor substrate，IRS）、磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）、蛋白激酶 B（protein kinase B，AKT），进而提高下游的内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性，促使内源性一氧化氮（NO）输出，最终起到舒张血管、扩大血流量的作用。可见扩大机体内NO的产量对糖尿病引发的由微循环开放减少引起的心血管并发症有重要的意义。PI3K/AKT/eNOS信号通路可体内调控NO产量。恢复PI3K/AKT/eNOS信号通路级联效或可改善内皮细胞损伤。为明确SGLT抑制剂对血管内皮细胞的作用，本研究通过软脂酸（palmitic acid，PA）建立人脐静脉内皮细胞的胰岛素抵抗模型，分析SGLT表达水平的改变，并探讨抑制SGLT对PI3K/AKT/eNOS通路的影响，及对胰岛素抵抗下内皮细胞损伤的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人脐静脉内皮细胞由中国科学院细胞库提供；PA、不含游离脂肪酸的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）和 SGLT 抑制剂根皮苷（phloridzin，PH）购自美国Sigma公司；兔SGTT1、兔SGLT2、兔磷酸化eNOS（p-eNOS）、eNOS抗体、兔GAPDH抗体、兔胰岛素底物受体 1（IRS-1）、兔磷酸化 IRS-1（p-IRS-1）购于美国Cell Signaling公司；兔磷酸化 AKT（p-AKT）、AKT 抗体购自美国Bioworld Technology公司；NO试剂盒购自美国Cayman公司；ECL化学发光试剂盒、预染蛋白Marker、PCR扩增试剂盒购自美国Thermo公司；PI3K抑制剂LY294002购于美国Sigma公司；SGLT、GAPDH引物购于上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及干预 将人脐静脉内皮细胞分为空白对照组（DMSO组）、PA组、PA+Insulin组、PA+PH组、PA+PH+LY组。DMSO组细胞加入DMSO处理，作对照用；PA组用0.3 mmol/L PA干预18 h建立胰岛素抵抗模型；PA+Insulin组、PA+PH组在PA组处理的基础上再分别给予100 nmol/L胰岛素、PH干预30 min；PA+PH+LY组预先加入100 nmol/L LY294009孵育30 min，后再加入PH干预30 min。

1.2.2 各组细胞 SGLT1、SGLT2、p-IRS-1、p-AKT、peNOS蛋白表达水平检测 采用Western blot法。各组细胞培养完成后加入细胞裂解液刮取蛋白液，离心取上清液，使用考马斯亮蓝测定蛋白浓度。通过凝胶电泳分离蛋白后电转至膜上。5%脱脂奶粉封闭2 h，缓冲液洗去脱脂奶粉（5 min×3次），兔 SGTT1、兔SGLT2、兔eNOS、兔 p-eNOS、兔 AKT、兔 p-AKT、兔 IRS-1、兔 p-IRS-1及兔GAPDH抗体4℃孵育过夜，洗膜（5 min×3次），IgGⅡ抗（1:5 000）室温孵育1 h，最后再洗膜3次，用ECL化学发光法成像，Quantity One软件分析蛋白表达水平。

1.2.3 各组细胞 SGLT1、SGLT2 mRNA表达水平检测 采用RT-PCR法。细胞干预完成后用苯酚-氯仿一步法提取总RNA，用核酸蛋白分析仪测浓度及纯度后，按说明书操作合成互补DNA，通过荧光定量PCR分析系统进行检测，以GAPDH为内参照，测定细胞内目的基因的相对含量。引物序列和退火温度见表1。

1.2.4 各组细胞NO浓度检测 采用硝酸盐还原酶法。收集各组细胞的上清液，依次加入硝酸盐还原酶、酶反应因子室温孵育30 min，继续加入2,3-二氨基萘（DAN）试剂孵育10 min，最后加入氢氧化钠溶液，使用多功能酶标仪依次测量各孔的荧光值，最后根据标准曲线算出相应样品的NO浓度。

1.2.5 各组细胞葡萄糖消耗量检测 采用葡萄糖测定试剂盒检测。收集各组细胞的上清液，根据试剂盒中提示的步骤，采用葡萄糖还原酶法检测各组细胞葡萄糖的消耗情况。

1.2.6 siRNA的转染和实验分组 当人脐静脉内皮细胞生长到约60%～70%的融合面积时进行siRNA转染以沉默SGLT1和SGLT2，分为DMSO组、PA组和PA+si-Ctrl组、PA+si-SGLT1组、PA+si-SGLT2组，其中 PA+si-Ctrl组细胞用无意义片段转染。最后采用Western blot法检测 p-IRS-1、p-AKT、p-eNOS 蛋白表达水平，方法同1.2.2。

1.3 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DMSO组、PA组、PA+PH组细胞 SGLT1、SGLT2蛋白和mRNA表达水平比较 DMSO组细胞表达少量的SGLT1、SGLT2蛋白和 mRNA，PA 组细胞 SGLT1、SGLT2蛋白和mRNA表达水平较DMSO组增加（均P＜0.05），PA+PH组细胞SGLT1、SGLT2蛋白和mRNA表达水平较PA组降低（均P＜0.05），见图1。

图1 DMSO组、PA组、PA+PH组细胞钠葡萄糖其转运体1（SGLT1）、SGLT2蛋白和mRNA表达水平比较（a：蛋白表达电泳图；b、c：蛋白表达水平比较；d、e：mRNA 表达水平比较；*P＜0.05，**P＜0.01）

2.2 DMSO组、PA组、PA+Insulin组、PA+PH组细胞葡萄糖消耗量与NO浓度比较 PA组细胞葡萄糖消耗量与NO浓度均低于DMSO组（均 P＜0.05），PA+Insulin组、PA+PH组细胞葡萄糖消耗量与NO浓度均高于PA组（均 P＜0.05），见图 2。

图2 DMSO组、PA组、PA+Insulin组、PA+PH组细胞葡萄糖消耗量与NO浓度比较（a：葡萄糖消耗量比较；b：NO浓度比较；*P＜0.05，**P＜0.01）

2.3 DMSO组、PA组、PA+PH组、PA+PH+LY组细胞p-IRS-1、p-AKT、p-eNOS蛋白表达水平及NO浓度比较 PA组细胞p-IRS-1、p-AKT、p-eNOS蛋白表达水平及NO浓度均低于DMSO组（均P＜0.05）。PA+PH组细胞p-AKT、p-eNOS蛋白表达水平及NO浓度均较PA组升高（均P＜0.05），但p-IRS-1蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。PA+PH+LY组细胞p-AKT、p-eNOS蛋白表达水平均较PA+PH组降低（均P＜0.05），但p-IRS-1蛋白表达水平及NO浓度比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），见图3。

2.4 DMSO 组、PA 组、PA+si-Ctrl组、PA+si-SGLT1组、PA+si-SGLT2组细胞 p-IRS-1、p-AKT、p-eNOS蛋白表达水平比较 PA+si-SGLT1组、PA+si-SGLT2组细胞p-AKT、p-eNOS蛋白表达水平均明显高于PA组和PA+si-Ctrl组（均P＜0.05）。与 DMSO 组相比，p-IRS-1在 PA组、PA+si-Ctrl组和 PA+si-SGLT1组、PA+si-SGLT2组明显下调，但组间比较均无统计学差异（均P＞0.05），见图 4。

3 讨论

图3 DMSO组、PA组、PA+PH组、PA+PH+LY组细胞磷酸化胰岛素底物受体1（p-IRS-1）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、内皮型—氧化氮合酶（p-eNOS）蛋白表达水平及NO浓度比较（a：p-AKT蛋白表达电泳图和水平比较；b：p-eNOS蛋白表达电泳图和水平比较；c：p-IRS-1蛋白表达电泳图和水平比较；d：NO浓度比较；*P＜0.05，**P＜0.01）

图4 DMSO组、PA组、PA+si-Ctrl组、PA+si-SGLT1组、PA+si-SGLT2组细胞磷酸化胰岛素底物受体1（p-IRS-1）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）、内皮型—氧化氮合酶（p-eNOS）蛋白表达水平比较（a、b、c：蛋白表达电泳图；d、e、f：蛋白表达水平比较；*P＜0.05，**P＜0.01）

SGLT1、SGLT2是葡萄糖钠的共转运体，介导着细胞内外葡萄糖的转运[9]。SGLT抑制剂主要作用是通过抑制肾小管上皮细胞上葡萄糖的转运，增加尿糖的排泄，从而降低血糖值[10]。多项临床及动物研究显示其不仅可以显著降低心血管危险因素，改善糖尿病的心血管并发症[11-12]，并且能够改善肥胖大鼠的糖脂代谢异常，抑制炎症反应[13]。另有报道SGLT抑制剂在1型糖尿病小鼠中可以提高AKT、eNOS磷酸化水平，改善内皮功能[14]。SGLT在人体内广泛存在，有研究证明内皮细胞上存在SGLT[15]。因此深入研究其在内皮细胞上的作用靶点和具体机制是进一步所要解决的问题。

PA作为一种游离脂肪酸，可以很好地模拟2型糖尿病患者血管内皮细胞中高游离脂肪酸的环境[16-17]，其在体内干预胰岛素受体底物与胰岛素的结合，干扰信号传导，介导着胰岛素抵抗[18]，另一方面PA抑制了AKT/eNOS信号通路的传递，而eNOS是体内重要的蛋白激酶，介导着细胞的增殖，迁移和代谢反应[19]，p-eNOS介导了内皮源性的NO生成，NO作为最强的舒血管因子，对维持血管稳态起着关键作用[20]。研究结果表明PA可以提升内皮细胞SGLT1、SGLT2含量增加，并且在PA环境下AKT、eNOS磷酸化水平的降低直接导致了内皮源性的NO输出减少，这与前人的研究结论相符[21]。本研究发现PH可逆转PA诱导的细胞功能障碍，随着p-AKT、p-eNOS水平的上调，NO产量增加。通过PI3K抑制剂也进一步证实了是通过AKT上游分子PI3K，使p-AKT、p-eNOS和NO水平上调。因此认为PH可能通过抑制SGLT的功能和异常表达，激活PI3K/AKT/eNOS信号通路传递。此外本研究发现PH对PA诱导的p-IRS-1的下调没有缓解作用，可能其并不通过IRS-1发挥功能。正常情况下，IRS是胰岛素信号转导通路中重要的信号蛋白，IRS-1激活下游的PI3K/AKT，调控着细胞的生长、增殖等作用[22]，然而IRS有很多亚型，因此还需要进一步实验检测PA可能存在的作用位点。最后本研究通过选择性沉默细胞的SGLT1、SGLT2基因，发现在PA环境下AKT/eNOS的磷酸化水平并没有下降，进一步验证了在PA诱导下SGLT1、SGLT2与AKT/eNOS信号通路的关系，发现了其保护内皮细胞的潜在作用机制。

综上所述，降低SGLT1、SGLT2表达，激活 PI3K/AKT/eNOS通路，增加NO的输出可能是SGLT抑制剂保护血管内皮的作用机制。本研究使用PH培养细胞的时间较短，长时间的应用效果应该会更加明显。PA诱导内皮细胞损伤和SGLT1、SGLT2表达异常，使细胞代谢障碍，模拟了2型糖尿病患者体内高游离脂肪酸和代谢异常的情况。本研究发现SGLT抑制剂在降糖的同时改善了高游离脂肪酸造成的内皮细胞损伤，有延缓心血管并发症发生、发展的可能性。尽管PA较好地模拟了内皮细胞胰岛素抵抗的模型，为今后探讨抑制SGLT对内皮细胞的进一步深入研究打下了基础，但是该模型仍然无法完全模拟在体内皮细胞胰岛素抵抗的状态。并且PA在人脐静脉内皮细胞上的具体靶点还需要进一步验证，以及在体实验的完善。抑制SGLT为改善胰岛素抵抗、降低糖尿病心血管并发症的发生提供了新的选择和希望。