保肾通络方含药血清对高糖培养下足细胞p38 通路及凋亡的作用研究

崔方强，王悦芬，孟 元，蔡 朕，江心灿，赵文景*

（1.首都医科大学附属北京中医医院，北京 100010；2.首都医科大学中医药学院，北京 100069）

糖尿病肾病（DN）发病率呈现逐年升高的趋势，已经成为导致终末期肾病十分重要的原因[1-2]。但是糖尿病肾病的发病机制复杂，目前并未完全阐明。因此糖尿病肾病缺乏针对性并且有效的临床防治措施。多项研究均已证实，糖尿病肾病中足细胞会发生凋亡，而足细胞凋亡在DN 的发生及进展过程中起着至关重要的作用[3-5]。高糖刺激会导致足细胞p38 信号通路激活，进而激活线粒体凋亡途径，最终引起caspase-3蛋白激活[6-7]。Caspase-3 蛋白激活直接介导足细胞凋亡及蛋白尿的产生，进而导致疾病的进展。研究发现，抑制足细胞p38 通路激活、减轻足细胞凋亡，可以有效的延缓DN 疾病的进展[8-9]。保肾通络方是首都医科大学附属北京中医医院肾病科协定处方，被广泛应用于DN 的临床防治。此外临床试验已经证实，保肾通络方临床防治DN 疗效确切[10]。本实验观察了保肾通络方对于高糖培养下足细胞p38 通路及足细胞凋亡的影响，阐明其防治DN 的分子机制。

1 材料和方法

1.1 实验材料 8 周龄雄性SD 大鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物许可证号：SCXK（京）2014-0004。实验细胞采用条件永生小鼠足细胞系，购于北纳生物科技有限公司，批号：BNCC337685。CCK-8 试剂盒（碧云天生物，C40042），Hochest33258染料（Solarbio，C0021-1ml），DMEM低糖培养基（Genview，GD3114-500ml），葡萄糖（Sigma，SLBC6575V），甘露醇（Sigma，WXBC2419V），胎牛血清（Sciencell，17985），P38 抗体（abcam，ab121828），P-p38 抗体（abcam，ab47363），Caspase-3 抗体（abcam，ab13847），FITC 标记的羊抗小鼠IgG（凯基生物，KGAA25），保肾通络方颗粒剂，由首都医科大学附属北京中医医院药剂科制备，每1 g 颗粒剂含4.01 g 生药，临床成人用量为每日1.91 g（生药）/kg。酶标仪（北京市新风机电技术公司，ZS-3），电泳仪(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，DG-300C) ; 迷你双垂直电泳槽(北京市六一仪器厂，DYCZ-24DN) ; 迷你转印电泳槽(北京市六一仪器厂，DYCZ-40D)，凝胶化学发光成像分析系统（FUSION FX6 XT,Vilber 公司），离心机(Sigma，3K18)；倒置显微镜（德国Leica 公司）；激光共聚焦显微镜（TCS SP8 STED，Leica，德国）。

1.2 实验方法

1.2.1 含药血清制备 20 只8 周龄雄性SD 大鼠随机分为空白血清组、保肾通络方低剂量组、保肾通络方中剂量组及保肾通络方高剂量组，每组5 只。将保肾通络方分别配制成浓度为0.5、1、2 g/mL 的低、中、高剂量的灌胃剂。保肾通络方低、中、高剂量组分别予相应的灌胃剂灌胃。各组大鼠每天灌胃2 次，每次灌胃2 mL，连续灌胃7 d。末次灌胃后，待血药浓度稳定后麻醉大鼠，1%戊巴比妥钠按照40 mg/kg 剂量麻醉大鼠，腹主动脉取血，分离血清。将不同组别血清56 ℃水浴30 min，无菌滤器过滤除菌，－80 ℃冰箱保存。

1.2.2 细胞培养及分组给药 条件永生小鼠足细胞系移入25 cm2培养瓶，并加入含有10%胎牛血清的DMEM 完全培养基4～5 mL。将足细胞放入37 ℃、95%空气和 5% CO2的细胞培养箱内培养，待细胞增殖到80%融合时，进行无血清处理。然后足细胞分为不同组别：正常对照组（NC）（低糖培养基加甘露醇加空白血清），模型组（HG）（含30 mmol/L 葡萄糖的高糖培养基加空白血清），保肾通络方含药血清低（BSF-L）、中（BSF-M）、高（BSF-H）剂量组（含30 mmol/L 葡萄糖的高糖培养基加低、中、高剂量保肾通络方含药血清）。不同组别足细胞进行不同的干预措施，干预时间为24 h。然后进行细胞收集或细胞固定，用于后续实验。

1.2.3 CCK-8 检测 将重悬的小鼠足细胞种植于96 孔板中，保证每孔细胞数目一致且不少于10 000 个细胞。将96 孔板放入细胞培养下培养，待细胞贴壁并且生长状态良好后，给予不同的干预措施。干预24 h 后向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，37 ℃孵育2 h。然后将96 孔板放置在酶标仪上，在450 nm 条件下测定各孔OD 值，并根据OD 值测定细胞活力。细胞活力（%）=（加药细胞OD/对照细胞OD）×100%。

1.2.4 Hochest33258 染色 将消毒好的玻璃片放入12孔板，将足细胞悬液滴加至玻璃片上，加入DMEM 完全培养基，进行细胞爬片。待细胞贴壁并状态良好后给予不同干预措施，干预24 h 后用4%多聚甲醛固定细胞30 min，0.5%Triton X-100 室温透膜20 min，然后用配置好的Hochest33258 染料染色30 min，甘油封片。共聚焦显微镜观察各组足细胞凋亡情况。每组随机选取15 个视野，计算凋亡细胞数目，进行统计学分析。

1.2.5 细胞免疫荧光 将消毒好的玻璃片放入12孔板，将足细胞悬液滴加至玻璃片上，加入DMEM 完全培养基，进行细胞爬片。待细胞贴壁并状态良好后给予不同干预措施，干预24 h 后用4%多聚甲醛固定细胞30 min，0.5%Triton X-100 室温透膜20 min，山羊血清封闭30 min。滴加稀释好的一抗至玻璃片上，4 ℃孵育过夜，PBS 清洗后，二抗室温孵育2 h，DAPI 染核5 min，甘油封片。共聚焦显微镜下观察蛋白分别及表达情况。每组随机选取15 个视野，计算荧光强度，进行统计学分析。

1.2.6 Western blot 将裂解液加入收集的足细胞中，进行组织裂解，离心后取上清，完成蛋白提取。然后用BCA 法进行蛋白定量。将等量的蛋白提取液加入孔槽中，利用10%SDS-PAGE 凝胶进行蛋白电泳。电泳结束后，将分离的蛋白转移至PVDF 膜上，然后滴加稀释号的一抗，4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗，室温孵育2 h，ECL 试剂暗室内胶片曝光，扫描胶片，用图像分析软件分析目标条带。

1.2.7 RT-PCR 将Trizol 加入收集好的足细胞中，反应5 min 后加入氯仿，5～10 min 后离心提取最上层液体，然后向最上层液体依次加入预冷异丙醇、75%DEPC 乙醇，最后加入DEPC 处理过的水溶解沉淀，完成足细胞中的总RNA 的提取。然后用反转录试剂盒将提取的mRNA 转录为cDNA。实时荧光定量PCR 仪进行扩增及荧光定量，采用 2－△△CT法进行数据的相对定量分析。利用Primer 5.0 软件设计引物序列，见表1。

表1 引物序列

1.2.8 统计学分析 采用SPSS 17.0 进行统计处理，计量资料以均数±标准差（）表示。统计数据均符合正态分布且方差齐，组间比较采用单因素方差分析数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA），多重比较采用LSD 检验。

2 结果

2.1 保肾通络方含药血清对高糖培养足细胞活力影响 CCK-8 法检测不同组别足细胞活力。与正常对照组相比，高糖组足细胞活力明显降低（P＜0.05），与模型组相比，保肾通络方含药血清组足细胞活力明显升高（P＜0.05）。实验结果表明，高糖刺激可以显著降低足细胞活力，而保肾通络方含药血清可以升高足细胞活力。见图1。

图1 不同组别足细胞活力比较

2.2 保肾通络方含药血清对高糖培养足细胞p38 及P-p38 蛋白表达影响 WB 检测不同组别足细胞p38 及P-p38 蛋白表达。p38 蛋白表达水平在不同组别之间没有统计学差异（P＞0.05）。与正常对照组相比，高糖组足细胞P-p38 蛋白表达明显上调（P＜0.05）；与高糖组相比，保肾通络方含药血清组足细胞P-p38 蛋白表达明显下调（P＜0.05）。实验结果表明，高糖刺激可以显著激活足细胞p38 信号通路，而保肾通络方含药血清可以抑制高糖引起的p38 信号通路激活。见图2。

图2 不同组别足细胞P-p38 及p38 蛋白表达比较

2.3 保肾通络方含药血清对高糖培养足细胞caspase-3蛋白及mRNA 表达影响 免疫荧光及RT-PCR 检测不同组别足细胞caspase-3 蛋白和mRNA 表达。研究结果显示，与正常对照组相比，高糖组足细胞caspase-3蛋白及mRNA 表达明显上调（P＜0.05），与高糖组相比，保肾通络方含药血清组足细胞caspase-3 蛋白及mRNA 表达明显下调（P＜0.05）。实验结果表明，高糖刺激可以显著上调足细胞caspase-3 蛋白及mRNA表达，而保肾通络方含药血清可以下调高糖培养下足细胞caspase-3 蛋白及mRNA 表达。见图3。

图3 不同组别足细胞caspase-3 蛋白及mRNA 表达比较

2.4 保肾通络方含药血清对高糖培养足细胞凋亡的影响 Hochest33258 染色检测不同组别足细胞的凋亡情况。与正常对照组相比，高糖组足细胞凋亡数目明显升高（P＜0.05），与模型组相比，保肾通络方含药血清组足细胞凋亡数目明显降低（P＜0.05）。实验结果表明，高糖刺激可以引起足细胞凋亡，而保肾通络方含药血清可以减轻高糖培养下足细胞的凋亡。见图4。

图4 不同组别足细胞凋亡数目比较

3 讨论

DN 是糖尿病重要的微血管并发症，也是导致ESRD 的主要原因[1-2]。DN 目前的治疗措施有限，并且缺少针对DN 发病机制的有效治疗措施。因此尽管已经采取了早期积极的临床干预措施，我们并未有效的延缓DN 疾病的进展。多项研究均已证实，足细胞凋亡是DN 疾病进展的重要病理机制[3-5]。肾小球滤过膜由内皮细胞、基底膜及足细胞的足突三层结构组成，其中足细胞足突是肾小球滤过膜最为重要的组成部分。足细胞凋亡会导致粘附在基底膜上的足突结构破坏，导致蛋白尿的产生及疾病的进展[11-13]。此外足细胞是一种终末分化期细胞，失去了再生增殖的能力，因此足细胞凋亡引起的肾小球滤过膜的破坏无法得到再生修复。P38 信号通路是介导DN 足细胞凋亡的关键信号通路。在DN 中，高糖刺激会引起足细胞p38 信号通路显著激活，导致P-p38 蛋白表达上调。P38 通路激活后会引起促凋亡蛋白Bax 表达上调，抑制凋亡蛋白Bcl-2 表达下调，进而引起caspase-3 激活，最终介导足细胞凋亡[14-15]。研究发现，抑制足细胞p38 通路激活，减轻足细胞凋亡能够有效的延缓DN 疾病进展，可能成为DN 防治新的治疗靶点[16-17]。

中医药并没有DN 的疾病名称，从临床症状上看应属于“水肿”“尿浊”“关格”的疾病范畴。针对DN 的中医病因病机，不同的医家具有不同的认识，形成不同的理论学说如微型癥瘕学说[18]、毒损肾络学说[19]。全国名老中医、首都国医名师张炳厚教授根据五十多年临床经验，提出“肾气精两虚，肾失封藏，肾络闭阻”是DN 发病的核心病机。消渴初期多为阴虚燥热，继而出现气血凝滞，络脉闭阻，日久耗伤肾之气精，导致肾失封藏，精微下泄。因此张炳厚教授以补肾通络为DN 的治则，并取得很好的临床疗效。保肾通络方就是补肾通络的代表方药，其是首都医科大学附属北京中医医院肾病科协定处方，被广泛应用于DN 的临床防治。临床试验已经证实，保肾通络方具有降低蛋白尿、改善肾功能的作用[10]。基础实验证实，保肾通络方能够改善KK-Ay 小鼠肾脏病理改变，并且能够上调KK-Ay 小鼠足细胞nephrin 蛋白表达，下调desmin 蛋白表达，进而减轻足细胞损伤[20]。但是保肾通络方减轻足细胞损伤的分子机制目前并不清楚。

本实验首先观察了保肾通络方含药血清对于高糖培养下足细胞活力及足细胞凋亡的影响。实验结果表明，高糖刺激可以引起足细胞活力降低，导致足细胞凋亡；而保肾通络方含药血清可以升高高糖培养下足细胞活力，并能减轻足细胞凋亡。鉴于p38 信号通路在DN 足细胞凋亡中的关键作用，本实验观察了保肾通络方含药血清对高糖培养下足细胞p38 蛋白及P-p38蛋白表达的影响。实验结果表明，保肾通络方含药血清能够下调高糖培养下足细胞P-p38 蛋白表达，抑制p38 通路激活。本实验又观察了不同组别足细胞p38通路介导的凋亡相关蛋白caspase-3 的表达。实验结果表明，保肾通络方含药血清能够下调高糖培养下足细胞caspase-3 蛋白表达。本实验结果证实，保肾通络方含药血清能够抑制高糖培养下足细胞p38 信号通路激活，减轻足细胞凋亡。本实验为保肾通络方临床防治DN 提供了科学依据，但是至于其减轻DN 足细胞损伤的其他分子机制有待进一步研究。