高产乙酸乙酯酵母菌筛选及固态发酵应用研究

刘小改，马美荣，周林艳，王小伟，张 坤

（北京红星股份有限公司，北京 101400）

乙酸乙酯是清香型白酒中特征香气成分，通常表现为水果香、花香和甜香，对增加白酒香气、醇厚度、提升白酒品质有重要作用[1]。二锅头白酒作为清香型白酒代表之一，其中乙酸乙酯的含量是衡量酒质好坏的重要标准之一[2]。清香型白酒酿造过程中，乙酸乙酯主要来自于产酯酵母。产酯酵母又称生香酵母，是一类能够代谢生成酯类物质的酵母菌总称，通常包括汉逊酵母属（Hansenula）、毕赤酵母属（Pichia）、假丝酵母属（Candida）等[3-5]。该类酵母能够在生长繁殖过程利用葡萄糖代谢产生乙醛、乙酸，并在其自身酯化酶的催化作用下合成乙酸乙酯[6]。在我国，应用生香酵母提高白酒质量始于20世纪60年代初期，前沈阳轻院与锦州酒厂就用生香酵母明显地提高了麸曲白酒的酒质，而真正商品化的生香酵母是于1995年由湖北宜昌安琪酵母基地开始生产的，当生香酵母被制成活性干酵母后，既充分发挥了增酯作用，又方便了运输、贮存及使用[7]。史雁飞[8]通过应用酵母细胞固定化技术，增强了产酯酵母生长繁殖能力，提高细胞活性和抗逆性，并达到反复利用的目的，极大地提升了产酯酵母的应用效果。刘桂君等[9]在液态发酵生产白酒时用生香酵母与红曲、酿酒酵母共同发酵，所获白酒乙酸乙酯的含量有较大幅度提高，酒的口味和香气均有改善。宋玉华等[10]在清香酒生产中添加固体产酯酵母入池发酵，乙酸乙酯含量明显提高，且酒质甘爽余味长，清香风格明显。

产酯酵母菌代谢产酯受诸多因素影响，如发酵培养基、温度、时间、pH值、供氧情况等。与兼性厌氧的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）可在无氧条件下繁殖代谢不同，大多数产酯酵母为需氧菌，必须在有氧条件下生长代谢[11]，且白酒生产中酒醅酸度和发酵期是极为重要的发酵条件，直接影响白酒生产的质量和产量，因此研究发酵酒醅酸度、酒醅中溶氧情况、发酵时间对产酯酵母代谢的影响，可为产酯酵母在白酒酿造生产中应用提供重要的理论依据，这对于白酒生产的提质保量是极为必要的。

本研究通过对实验室保藏的5株酵母菌的乙酸乙酯生产能力进行研究，从中筛选出一株高产乙酸乙酯酵母菌，并对该菌株在白酒酿造过程中的固态发酵条件进行研究，考察粮糟比例、酒醅疏松度、发酵时间3个因素对其发酵产乙酸乙酯效果的影响，其中，通过调整粮糟比例调节酒醅入池酸度，通过调整酒醅疏松程度调节入池酒醅中氧气含量，确定最佳发酵条件。进一步在酿造中试车间应用产酯酵母J-4进行发酵增酯实验，并以未添加产酯酵母发酵的酒班为对照，对两班所产原酒指标进行分析对比，并对酒样进行感官品评，以验证和评估该株产酯酵母在大生产中的应用性能及效果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

酵母菌株J-1、J-2、J-3、J-4、J-5：北京红星股份有限公司从清香型酒曲中分离并保存；安琪酿酒高活性干酵母：安琪酵母股份有限公司。

1.1.2 试剂

玉米粉：市售；白酒蒸馏酒尾、麸曲、高粱粉、酒糟、稻壳：北京红星股份有限公司酿造车间；酚酞（分析纯）：福晨（天津）化学试剂有限公司；氢氧化钠（分析纯）：北京化工厂有限责任公司；乙醛、甲醇、正丙醇、乙酸乙酯、异丁醇、乳酸乙酯（纯度均≥99.0%）：中国计量科学研究院国家标准物质资源库；乙酸正戊酯（纯度≥99.0%）：西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司。

1.1.3 培养基

种子培养基[12]：8～10 °Bx玉米糖化液，pH 4.0～5.5，115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。玉米糖化液[13]：在糊化锅内加入原料质量6倍的水，打开蒸汽加热，同时均匀撒入原料玉米粉，要求玉米粉不得结块，蒸煮2 h糊化，糊化结束后料液降温冷却至60 ℃，加入原料质量20%的麸曲搅拌均匀，保持温度55～60 ℃，糖化3～4 h，糖化完毕后离心过滤，加水稀释至8～10°Bx糖度。

酒尾发酵培养基[14]：酒糟与水按质量比1∶4混合均匀后过滤，在浸出液中加入10%白酒蒸馏酒尾，酒尾酒精度为25%vol，115 ℃高压蒸汽灭菌20 min。

1.2 仪器及设备

GC-2010 plus气相色谱（gas chromatography，GC）仪：日本岛津公司；CJ-2DFS净化工作台：天津市泰斯特仪器有限公司；LDZX-50KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；DHP-9272电热恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；JJ6000型电子天平：常熟市双杰测试仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 酿酒高活性干酵母活化

将安琪酿酒高活性干酵母接种于玉米糖化液，混匀后于38 ℃活化30 min，备用[15]。

1.3.2 产酯酵母种子培养

自保藏斜面培养基挑取1环产酯酵母接种于装有种子培养基的试管中，28 ℃培养24 h，培养完成后按照10%（V/V）的接种量转接于装有种子培养基的三角瓶中，装液量100 mL/500 mL，28 ℃培养24 h[16-17]，作为种子液备用。

1.3.3 高产乙酸乙酯酵母菌的筛选

将酵母种子液按4%（V/V）的接种量转接于酒尾发酵培养基，28 ℃培养5 d，每天取发酵液检测乙酸乙酯含量。

1.3.4 白酒酿造工艺

操作要点：将高粱粉碎成粉状，酒糟、高粱粉按照不同配比混合均匀，加入稻壳、水，稻壳添加量为高粱粉质量的25%，适当加水调节醅料水分至55%左右，拌匀后100 ℃蒸料40 min，蒸料完成后物料经摊凉、降温至30 ℃左右，将高产乙酸乙酯酵母种子液按高粱粉质量的4%接种于固态发酵培养基中，同时按高粱粉质量加入8%麸曲、0.03%活化后的安琪酿酒高活性干酵母，并再次翻拌均匀后入池发酵。发酵完成后，将酒醅从发酵池中取出，装入甑锅中蒸馏取酒，蒸酒后酒糟按20%比例作为丢糟弃用，剩余80%酒糟作为回糟再次配粮后进行发酵应用。

1.3.5 高产乙酸乙酯酵母固态发酵实验

将醅料拌匀后装入不锈钢发酵桶（满桶容积0.014 m3）内，以不同力度压实醅料至与桶沿齐平，测量发酵桶内所装醅料质量，以带硅胶密封圈及排汽管的发酵桶盖封口，发酵桶置于室温状态下，待醅料发酵不同时间后蒸馏取酒，检测原酒中乙酸乙酯含量及出酒率。考察粮糟质量比（1.0∶3.5、1.0∶4.0、1.0∶4.5、1.0∶5.0、1.0∶5.5）、入池酒醅疏松度（不施压力、轻微压力、正常压力、加重压力）及发酵时间（6 d、7 d、8 d、9 d、10 d）对菌株JT-4产乙酸乙酯的影响。

1.3.6 麸曲白酒酿造生产

采用1.3.4发酵工艺，将醅料拌匀后转移至水泥发酵池（满池容积45 m3）内，以塑料薄膜覆盖，进行人工踩窖，室温状态下进行发酵。测定原酒出酒率及理化指标，并进行感官评价。

1.3.7 检测方法

挥发性成分的测定：采用气相色谱法检测原酒中挥发性成分的含量。色谱条件参照杨强等[18]的方法，并略作修改：LZP-930石英毛细管色谱柱（50 m×0.32 mm×1.00 μm）柱；氢火焰离子化检测器（flame ionization detector，FID）检测器，检测器温度230 ℃；进样口温度250 ℃；升温程序：50 ℃保持3 min，以6 ℃/min升至130 ℃，再以20 ℃/min升至180 ℃，保持1 min；载气为氮气（N2）；吹扫流量为3 mL/min；分流比为1∶30。根据保留时间定性[19]，采用内标法定量，内标物为乙酸正戊酯（质量浓度0.117 g/L）。

酸度的测定：根据T/CBJ 004—2018《固态发酵酒醅通用分析方法》进行测定[20]。

发酵醅料质量的测定：称量空发酵桶及封盖质量，向桶中装入醅料并封盖后再次称量总质量，用总质量减去空桶及盖的质量，即为所装发酵醅料质量。

发酵醅料密度的测定：发酵醅料密度=发酵桶所装发酵醅料质量/发酵桶满桶容积。其中，发酵桶满桶容积为0.014 m3。

原料出酒率的测定：原料出酒率=65%vol原酒产量/原料用量×100%[21]。

感官评价：根据GB/T 33405—2016《白酒感官品评术语》进行品评描述[22]。

2 结果与分析

2.1 高产乙酸乙酯酵母菌的筛选

以未接菌的培养基为空白对照，酵母菌株J-1、J-2、J-3、J-4、J-5在酒尾发酵培养基中培养2 d、3 d、4 d和5 d后，乙酸乙酯含量见表1。

表1 不同酵母菌株培养液中乙酸乙酯含量Table 1 Content of ethyl acetate in culture solution of different yeast strains

由表1可知，在5株酵母菌株中，菌株J-4产乙酸乙酯能力明显优于其他4株酵母，当培养4 d时，菌株J-4培养液中乙酸乙酯含量达到最高，为1.38 g/L，酵母菌在生成乙酸乙酯的同时也在不断代谢分解溶液中的乙酸乙酯，随着培养时间继续延长，菌体衰退，合成乙酸乙酯的能力降低，菌株J-4培养液中乙酸乙酯含量下降。通过实验对比可知，在5株酵母菌株中，菌株J-4具有较强的乙酸乙酯合成能力，故选择该株酵母菌进行后续实验。

2.2 高产乙酸乙酯酵母J-4固态白酒发酵实验

2.2.1 粮糟质量比对酵母菌J-4固态发酵产乙酸乙酯的影响

应用发酵桶为发酵容器，进行初步固态白酒发酵实验。以4.5 kg质量酒醅入发酵桶，压平至满桶高度（正常压力），加盖密封后于室温发酵6 d后，不同粮糟质量比对酵母菌J-4固态发酵入池酒醅酸度、出酒率及原酒中乙酸乙酯产量的影响见表2。

表2 不同粮糟质量比对菌株J-4固态发酵出酒率及乙酸乙酯产量的影响Table 2 Effect of different sorghum to vinasse ratio on liquor yield and ethyl acetate yield by solid-state fermentation with strain J-4

由表2可知，酵母菌J-4固态发酵过程中，随着粮糟质量比减小，即入池酒醅酸度上升，所产原酒中乙酸乙酯含量逐渐升高，出酒率随之降低，分析原因可能为产酯酵母利用发酵过程中生成的乙醇合成乙酸乙酯，导致出酒率下降。由此可见，在一定程度上提高酒醅入池酸度有利于酵母代谢生成乙酸乙酯。当高粱粉与酒糟质量比升高至1.0∶5.5时，虽然原酒中乙酸乙酯含量可达1.55 g/L，但出酒率仅为41.5%，损失较大，究其原因，除乙醇转化为乙酸乙酯造成出酒率下降外，较高的酒醅酸度在一定程度上对其他微生物生长代谢产生抑制作用，使发酵速度减慢[23-24]，从而导致出酒率降低。

通过数据对比可知，应用高产乙酸乙酯酵母菌J-4进行固态发酵，当高粱粉与酒糟质量比为1.0∶4.0、1.0∶4.5、1.0∶5.0，即入池酒醅酸度为0.9～1.3 mmol/10 g时，所产原酒均可同时具有较高的乙酸乙酯含量和较高的出酒率。综合考虑高乙酸乙酯含量原酒适用性较强及生产中对出酒率的要求，最终确定以高粱粉与酒糟质量比例1.0∶4.5为最佳粮糟质量比。

2.2.2 入池酒醅疏松度对酵母菌J-4固态发酵产乙酸乙酯的影响

酿酒酵母属兼性厌氧菌，可在无氧条件下进行生长代谢，而大多数生香酵母则需在有氧条件下生长代谢[25-26]。王瑞明等[27]研究表明，氧气对异常汉逊酵母（Hansenula anomala）酯类代谢起着很重要的作用。因此，通过调整发酵酒醅疏松程度调节发酵体系中氧气含量，考察其对酵母菌J-4发酵产乙酸乙酯的影响，高粱粉与酒糟质量比为1.0∶4.5，发酵时间为6 d，发酵结束后蒸馏取酒，计算出酒率并检测原酒中乙酸乙酯含量，结果见表3。

表3 不同酒醅疏松度对菌株J-4固态发酵出酒率及乙酸乙酯产量的影响Table 3 Effect of different pressure on liquor yield and ethyl acetate yield by solid-state fermentation with strain J-4

由表3可知，随着醅料疏松程度降低，酒醅内氧气含量减少，原酒中乙酸乙酯含量降低，出酒率逐步升高，酵母菌J-4代谢合成乙酸乙酯需在有氧条件下进行，降低发酵体系溶氧量对产酯酵母代谢产生影响，但对于无氧条件发酵产酒精的酿酒酵母来说，酒醅低含氧量有助于其代谢合成酒精。应用酵母菌J-4进行固态发酵，当采用正常压醅及加压压醅时，可在保持较高出酒率的基础上提高原酒中乙酸乙酯含量。由于正常生产中发酵池体积较大，投粮量较多（一般每池1～4 t投粮），很难实现前两种醅料状态，且低出酒率直接导致经济损失，因此生产中醅料入池后采用正常踩窖即可。

2.2.3 发酵时间对酵母菌J-4固态发酵产乙酸乙酯的影响采用高粱粉与酒糟质量比1.0∶4.5，醅料装入发酵桶后以正常压力压实，于室温下分别发酵不同时间，发酵结束后蒸馏取酒，考察不同发酵期对酵母菌J-4发酵产乙酸乙酯的影响，结果见表4。

表4 不同发酵时间对酵母J-4固态发酵出酒率及乙酸乙酯产量的影响Table 4 Effect of different fermentation time on liquor yield and ethyl acetate yield by solid-state fermentation with strain J-4

由表4可知，当酒醅发酵6～7 d时，主发酵期基本已经到达终点，无论是酿酒酵母发酵产酒精量还是产酯酵母代谢合成乙酸乙酯量，均已达到较高水平，继续延长发酵期，出酒率、乙酸乙酯含量增长幅度均有限，当发酵期延长至10 d时，原酒中乙酸乙酯含量明显降低，酒醅中乙酸乙酯趋于分解，且延长发酵周期会降低窖池使用效率，在一定程度上给原酒生产造成经济损失[28]，因此，确定7 d为原酒发酵周期。

2.3 高产乙酸乙酯酵母菌J-4的在麸曲白酒酿造生产中的应用

采用1.3.4发酵工艺，以水泥池为发酵容器，确定粮糟质量比为1.0∶4.5，发酵时间7 d，醅料入池后进行正常踩窖，进一步将酵母菌J-4应用于酿造车间规模化麸曲白酒生产中，以不添加酵母菌J-4组为对照。发酵结束后分别计算出酒率并检测所产原酒理化指标，结果见表5。

表5 原酒出酒率及理化指标Table 5 Liquor yield and physicochemical indicators of base liquor

由表5可知，酵母菌J-4组出酒率（45.3%）略低于对照组出酒率（45.7%），比对照组出酒率降低0.87%；酵母菌J-4组乙酸乙酯含量（1.07 g/L）明显高于对照组酒样（0.71 g/L），比对照组酒样增长50.7%。酵母菌J-4组乳酸乙酯含量低于乙酸乙酯含量，符合清香型白酒风格特点，乙醛、甲醇、正丙醇、异丁醇含量较低，有助于增加酒体风味及协调性。

分别对两组原酒酒样进行感官品评，结果见表6。

表6 原酒感官品评结果Table 6 Results of sensory evaluation of base liquor

由表6可知，在清香型麸曲白酒酿造过程中，通过添加酵母菌J-4，可显著提升原酒中乙酸乙酯含量，可明显改善原酒口感，增加酒体绵柔度及丰满度，提升原酒品质。

3 结论

筛选出一株具有高产乙酸乙酯能力的酵母菌株J-4，乙酸乙酯产量为1.38 g/L，其最优固态发酵条件为高粱粉与酒糟质量比1.0∶4.5，发酵时间7 d，酒醅入池发酵后，以正常压力进行压醅。在此最优条件下，所得原酒中乙酸乙酯含量为1.31 g/L，出酒率为46.3%，均达到较高水平。进一步将酵母菌J-4应用于麸曲白酒酿造生产，所产原酒中乙酸乙酯含量可达1.07 g/L，比对照组酒样增长50.7%；出酒率为45.3%，比对照组酒样降低0.87%。经品评，所得原酒口感、品质亦得到明显改善。因此，酵母J-4应用于清香型麸曲白酒酿造中，具有良好的增酯效果。