丹皮酚通过STAT3通路抑制IL-17A诱导的角质形成细胞活性和细胞因子分泌*

解欣然， 张 蕾， 刘 欣， 林 燕， 李 萍

（首都医科大学附属北京中医医院北京市中医研究所，银屑病中医临床基础研究北京市重点实验室，北京100010）

银屑病是一种自身免疫性皮肤病，主要表现为鳞屑、红斑和点状出血等，皮损处T 淋巴细胞浸润与角质形成细胞异常增殖和分化是银屑病发病的基本病理机制。辅助性T 细胞17（T helper 17 cells，Th17 cells）及其分泌的细胞因子白细胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）与银屑病的发病最为密切［1］。丹皮酚是丹皮和徐长卿的主要有效成分，其药理活性广泛，多用于治疗心脑血管、肿瘤、炎症、变态反应及免疫系统等疾病。丹皮清热凉血，活血散瘀，是治疗银屑病血热证的方剂中的常用中药之一。本研究通过IL-17A 诱导HaCaT 细胞生长，观察丹皮酚对HaCaT 细胞的活力，细胞因子的分泌，以及信号转导与转录激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）和细胞外信号调节激酶 1/2 （extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）的影响，探讨丹皮酚治疗银屑病的作用机制。

材料和方法

1 细胞

HaCaT 细胞株（人永生化表皮细胞）购于中国医学科学院基础医学研究所协和细胞资源中心。

2 主要试剂

丹皮酚购自Sigma-Aldrich；MEM 培养液、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和胰蛋白酶（0.25%）购自Gibco；重组人 IL-17A 蛋白购自 PeproTech；S3I-201（STAT3 抑制剂）购自Sellckchem；CCK-8 试剂盒购自东仁化学科技（上海）有限公司；Th1/Th2/Th17 CBA（cytometric bead array）试剂盒购自 BD Biosciences；IL-23 ELISA 试剂盒购自 eBioscience；PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成；cDNA 第1 链合成试剂盒和Real Super Mixture 试剂购自北京康为世纪生物科技有限公司；兔抗 STAT3、p-STAT3，ERK1/2 和p-ERK1/2 多克隆抗体购自CST；其他生化试剂均为国产分析纯。

3 主要仪器

酶联免疫测定仪（Thermo）；3-18K 台式高速冷冻离心机（Sigma）；倒置显微镜（Olympus）；ABI 7500 荧光定量 PCR 仪（Applied Biosystems）；流式细胞仪（BD）；凝胶电泳成像系统（Tanon）；半干转电泳槽、电泳仪（Bio-Rad）；Mini P-4 电泳槽和湿转电泳槽（Cavoy）。

4 主要方法

4.1 细胞培养 HaCaT 细胞用含 10% FBS，1×105U/L 青霉素、1×105U/L 链霉素的 MEM 培养液，在37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。将 HaCaT 细胞以1×108/L 接种于细胞培养板（瓶），细胞融合近80%时进行实验。

4.2 CCK-8 法测定细胞活力 将HaCaT 细胞接种于96 孔板，实验分组如下：（1）空白对照（control）组：无血清培养液；（2）模型（model）组：IL-17A 200 μg/L；（3）丹皮酚高剂量（paeonol 200 mg/L）组：paneonol 200 mg/L+ IL-17A 200 μg/L；（4）丹皮酚中剂量（paeonol 100 mg/L）组：paneonol 100 mg/L+ IL-17A 200 μg/L；（5）丹皮酚低剂量（paeonol 50 mg/L）组：paneonol 50 mg/L+ IL-17A 200 μg/L，每组设 8 个平行孔。细胞与药物共同作用24 h 后，进行指标检测。实验结束后，弃去培养上清，加入100 μL无血清培养液和10 μL CCK-8 溶液，孵育 2 h 后在酶标仪 450 nm 处检测吸光度（A）值，并计算药物抑制率，抑制率（%）=（模型组A值-给药组A值）/模型组A值×100%。

4.3 CBA 法检测Th1/Th2/Th17 细胞因子 吸取各组细胞上清，应用流式细胞仪检测Th1/Th2/Th17 类细胞炎症因子的水平，包括γ 干扰素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-10、IL-17A、IL-4、IL-6、IL-2 和肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），操作按 CBA 试剂盒说明进行。

4.4 ELISA 法检测细胞因子IL-23 HaCaT 细胞接种于培养板，丹皮酚设200 mg/L 和100 mg/L 剂量组，每组设4 个平行孔。细胞与药物共同作用24 h。实验结束后，分别吸取培养上清，3 000 r/min 离心10 min，应用ELISA 法检测细胞分泌的IL-23，操作按试剂盒说明进行。

4.5 Real-time PCR 法检测细胞因子和STAT3 的mRNA 表达 Trizol 法提取细胞总RNA，使用逆转录酶进行逆转录，得到相应的cDNA，以β-actin 为内参照，用Ultra SYBR Mixture 进行扩增，检测炎症细胞因子IL-23 和IL-6、趋化因子配体2［chemokine（C-XC motif）ligand 2，CXCL2］、CXCL8 和趋化因子配体20［chemokine （C-C motif） ligand 20，CCL20］和STAT3 的mRNA 表达。引物见表1。反应条件为：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，45 个循环。实验结果以 Ct 值反映基因 mRNA 含量，采用 2-ΔΔCt相对定量法进行组间比较。

4.6 Western blot法检测STAT3和ERK1/2的蛋白水平 HaCaT 细胞接种于培养板，实验分组同4.2，并加入阳性对照药物STAT3抑制剂（S3I-201 36 mg/L）。24 h 后收集细胞提取蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，取10 μg 蛋白样本，经 SDS-PAGE 后，转膜，用 3% 牛血清白蛋白封闭，分别加入相应抗体STAT3（1∶2 000）、p-STAT3（Tyr705）（1∶1 000）、ERK1/2（1∶4 000）和 p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）（1∶2 000），4 ℃孵育过夜。用 TBST 洗膜×5 次，每次 3 min，加入相应Ⅱ抗，室温孵育 1 h，TBST 洗膜 6 次，每次 3 min。ECL 加到膜上后反应3～5 min，胶片曝光5～10 min（曝光时间随不同光强度而调整），显影2 min，定影。实验结果用目的蛋白条带吸光度值/GAPDH条带吸光度值表示。

表1 real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

5 统计学处理

用SPSS 22.0 统计软件进行分析，实验数据均采用均数±标准差（mean±SD）表示，方差齐性用单因素方差分析（one-way ANOVE），多组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 丹皮酚对IL-17A刺激的HaCaT细胞活力的影响

IL-17A（200 μg/L）作用于HaCaT 细胞24 h 能够显著增加细胞的活力（P＜0.05）；100 mg/L 和200 mg/L 丹皮酚对细胞的活力呈现出显著的抑制作用（P＜0.05），对细胞活力的抑制率分别为28.81% 和45.76%，其药效作用具有剂量依赖性，见表2。

表2 丹皮酚抑制IL-17A诱导的HaCaT细胞活力Table 2.The HaCaT cell viability induced by IL-17A was inhibited by paeonol（Mean±SD. n=8）

2 丹皮酚对IL-17A 刺激的HaCaT 细胞分泌细胞因子的影响

应用CBA 法检测Th1/Th2/Th17类细胞相关炎症因子的水平，结果显示，在IL-17A 刺激HaCaT 细胞24 h 后，在细胞上清中（除刺激剂IL-17A 外）仅测到IL-6 的分泌，并且其在模型组的含量升高，而丹皮酚能够抑制 HaCaT 细胞分泌 IL-6（P＜0.05）；其它细胞因子含量较低，未被检测到。同时，ELISA 结果显示，IL-17A 刺激的HaCaT 细胞分泌IL-23 含量显著升高，丹皮酚各剂量组对细胞分泌的炎症因子IL-23 呈现不同的抑制趋势，但较模型组比较差异无统计学意义，见图1。

3 丹皮酚对IL-17A 刺激的HaCaT 细胞内细胞因子mRNA表达的影响

与空白对照组相比，模型组细胞内趋化因子CXCL2、CXCL8和CCL20 的mRNA 表达均显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，200 mg/L和100 mg/L 丹皮酚对细胞内的上述mRNA 表达均呈现出一定的抑制作用（IL-6 除外），其中，200 mg/L 丹皮酚能够显著抑制CXCL2、CXCL8和CCL20的mRNA表达，见图2。

4 丹皮酚对IL-17A 刺激的HaCaT 细胞信号转导通路STAT3和ERK1/2表达的影响

IL-17A 刺激 HaCaT 细胞使胞内 STAT3 的 mRNA水平及磷酸化STAT3（Tyr705）表达显著增加，100 mg/L 及 200 mg/L 丹皮酚均可抑制 STAT3 mRNA 的表达（P＜0.05），但 仅 200 mg/L丹皮酚对STAT3（Tyr705）磷酸化的抑制具有统计学意义（P＜0.05）；IL-17A 刺激后 HaCaT 细胞 ERK1/2 和磷酸化 ERK1/2（Thr202/Tyr204）蛋白水平均无显著差异，见图3、4。

讨 论

丹皮是临床治疗银屑病血热证的中药复方中的主要组成之一，丹皮酚是其主要活性成分，具有抗炎、抗肿瘤和调节免疫的作用，提示丹皮酚可能对于银屑病的免疫细胞浸润和角质形成细胞增殖有一定的作用。文献报道，丹皮酚可抑制角质形成细胞生长因子（keratinocyte growth factor，KGF）刺激的Ha-CaT细胞增殖，其机制是通过阻止细胞向S期和G2/M期转化，使细胞生长增殖停滞在G0/G1期，从而抑制银屑病的发生［2］。丹皮酚也可通过干预microRNA-155 调控细胞因子信号转导抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）/STAT3 途径来治疗银屑病［3-4］。丹皮酚还可能通过抑制c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）-丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路的活化，下调人β-防御素 2（human β-defensin 2，HBD-2）的表达治疗银屑病［5］。另有针对树突状细胞（dendritic cells，DCs）的研究显示，丹皮酚可通过抑制Toll 样受体7/8（Toll-like receptor 7/8，TLR7/8）通路中的MyD88 和TLR8，从而抑制DCs 细胞成熟和激活，以减轻咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样皮损［6-7］。

Figure 1.The results of HaCaT cells secreted cytokines inhibited by paeonol.Mean±SD. n=4.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs model group.图1 丹皮酚抑制HaCaT细胞分泌炎症细胞因子

Figure 2.The mRNA expression of cytokines in the HaCaT cells was inhibited by paeonol.Mean±SD. n=4.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs model group.图2 丹皮酚抑制HaCaT细胞内细胞因子的mRNA表达

Figure 3.The mRNA expression of STAT3 in the HaCaT cells was inhibited by paeonol.Mean±SD. n=4.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs model group.图3 丹皮酚抑制HaCaT细胞内STAT3的mRNA表达

Figure 4.The protein levels of STAT3 and ERK1/2 in the HaCaT cells were inhibited by paeonol.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs model group.图4 丹皮酚抑制HaCaT 细胞STAT3 和ERK1/2 蛋白水平的比较

银屑病具有多基因遗传背景，涉及到免疫、炎症、细胞增殖与凋亡、神经递质等多方面因素。银屑病发病机制尚无定论，目前普遍认为其发生发展是免疫系统失衡和角质形成细胞异常共同作用的结果。Th17 细胞及其分泌的IL-17 在银屑病发病中起重要作用。Th17细胞成熟分化是由STAT3和视黄醇类核内受体 γt（RAR-related related orphan receptor γt，RORγt）共同介导的，主要产生IL-17A 和IL-17F，这两种细胞因子与自身免疫性和炎症性疾病的发生密切相关。Th17 细胞分化由转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）与 IL-6 首先启动，随后自分泌产生IL-21 扩大其分化规模，激活STAT3，IL-23则在分化后期维持Th17细胞稳定和分化成熟，从而诱导角质形成细胞的异常增殖和分化，表现出银屑病的病理特征［8］。IL-23可以介导STAT3磷酸化过程，使STAT3 激活从而促进Th17 类细胞因子的分泌。IL-17 可以促进角质形成细胞产生血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和IL-23 等细胞因子［9］，从而再进一步刺激 Th17 细胞分泌。在银屑病皮损的角质形成细胞中，STAT3 表现为结构性激活，导致炎症细胞的浸润和斑块的形成［10］。

本实验结果表明，IL-17A（200 μg/L）刺激体外培养的HaCaT 细胞24 h 后，能够增强细胞的活力，使趋化因子CXCL2、CXCL8和CCL20的分泌增多，并能促进STAT3 磷酸化。丹皮酚为晶体化学物，水溶性差，用0.1%DMSO 溶解后，加入到正常培养的HaCaT细胞中，通过实验证实200 mg/L 浓度以下丹皮酚无细胞毒作用。丹皮酚（50～200 mg/L）对于IL-17A 刺激的HaCaT 细胞的活力有一定的抑制作用，且呈剂量依赖性。

采用CBA 方法检测Th1/Th2/Th17 类细胞因子，只有IL-6 被检测到且于IL-17A 刺激后显著升高，提示IL-17A刺激的HaCaT细胞分泌的炎症因子IL-6分泌较多，其它细胞因子分泌较少，并且丹皮酚能够抑制IL-6 的分泌，但是，IL-6 的mRNA 表达增加不受影响，即丹皮酚可能在IL-6 转录后发挥作用。文献报道，IL-6 是IL-17 产生的关键激活剂，在银屑病患处皮损中mRNA 和蛋白质水平上都呈高表达［11］。相反地，由记忆T 细胞释放的IL-17 仅减少IL-6 mRNA 的降解，但对IL-6基因的转录无影响。IL-17 主要对IL-6 进行转录后调节，增强IL-6 对次级刺激的反应，而对于它自身只是一种较弱的促炎反应［12］。较高水平的IL-6可能会通过DCs和相关的Th17细胞传递抗原呈递信号。由巨噬细胞、T细胞和角质形成细胞产生的其它IL-6 增强病变皮损中富含IL-6 的微环境，从而刺激记忆/效应T 细胞群中STAT3 的磷酸化激活。丹皮酚对IL-6 蛋白水平抑制作用能够进一步阻止Th17 细胞分泌IL-17A。丹皮酚对IL-17A 诱导的HaCaT 细胞分泌的IL-23 mRNA 和蛋白表达均有一定的抑制作用。IL-23是Th17途径的关键上游因子，在银屑病皮损中呈高表达，并且是维持Th17 细胞的重要细胞因子。尽管IL-23 主要由树突状细胞分泌，但在银屑病皮损中角质形成细胞也分泌IL-23［13］。IL-17 刺激HaCaT 细胞分泌IL-23，可以验证IL-23/Th17 轴在该细胞模型的环路形成。由此可见，丹皮酚对IL-23/Th17 轴具有直接作用，并通过抑制IL-23的分泌对银屑病发挥治疗作用。

IL-17 作用 HaCaT 细胞 24 h 后，细胞内趋化因子CXCL2、CXCL8和CCL20 mRNA 表达显著升高，200 mg/L丹皮酚对高表达的趋化因子均有显著的抑制作用。银屑病患处皮损中角质形成细胞是CXCL2的主要来源，CXCL2 与主要表达于单核细胞表面的趋化因子受体CCR2 结合后，单核细胞向巨噬细胞分化，从血流向炎症部位迁移。这个过程会导致斑块的形成［14］。同时，CXCL2 也参与角质形成细胞的增殖和新血管形成。CXCL8或IL-8可维持中性粒细胞的聚集［15］。促炎细胞因子如 TNF-α，IL-1，IL-17和IFN-γ能显著刺激角质形成细胞中CCL20 的产生［16］。CCL20 在正常皮肤的角质形成细胞和内皮细胞中低水平表达，在银屑病皮损表皮细胞基底层呈高表达。此外，CCR6+Th17 细胞可促进CCL20 分泌，引起更多的CCR6+Th17 细胞募集［17］。由此可见，丹皮酚可通过抑制趋化因子 CXCL2、CXCL8和CCL20 阻止 T 淋巴细胞、嗜中性粒细胞和树突状细胞的聚集来抑制炎症。丹皮酚抑制趋化因子的作用可能成为银屑病治疗的一个研究方向。

STAT3 和ERK1/2 作为细胞增殖的重要细胞内信号通路蛋白，可被IL-17 激活，在银屑病角质形成细胞增殖中发挥重要作用［18］。本研究结果显示，丹皮酚对HaCaT 细胞内STAT3 mRNA 和蛋白表达有显著的抑制作用，对STAT3 蛋白磷酸化的抑制作用尤为显著，与STAT3 抑制剂的作用一致。STAT3 信号通路与细胞的生长、增殖和凋亡相关，STAT3 的持续活化可导致异常的细胞增殖和恶性转化。在银屑病中STAT3 磷酸化激活是特异性的，磷酸化STAT3 是Th17 细胞分化和 IL-17 分泌的关键转录因子［19］。咪喹莫特诱导的STAT3 转基因小鼠银屑病样皮损红斑、鳞屑、浸润较单纯咪喹莫特诱导的小鼠显著加重，提示STAT3在银屑病发病机制中的重要作用［20］。但是，丹皮酚对ERK1/2 和p-ERK1/2 的表达无显著作用，这表明丹皮酚可能通过STAT3磷酸化途径-IL-23/Th17轴减轻银屑病症状。

综上所述，丹皮酚能够抑制IL-17A 刺激的Ha-CaT 细胞的活力，抑制细胞因子IL-23 和IL-6 的分泌和趋化因子CXCL2、CXCL8和CCL20的mRNA 表达，以及STAT3的mRNA和蛋白表达。