夏枯草膏中异迷迭香酸苷水提工艺优化

王 建 李正国 刘琳琳

山东省济宁市食品药品检验检测中心，山东济宁 272000

夏枯草为唇形科植物夏枯草（Prunella vulgarisL.）的干燥成熟果穗，夏季果穗呈棕红色时采收，除去杂质，晒干。具有清肝泻火、明目、散结消肿之功效[1]。临床用于治疗目赤肿痛、目珠夜痛、头痛眩晕、瘰疬、瘿瘤、乳痈肿痛、甲状腺肿大、淋巴结结核、乳腺增生、高血压等症[2-4]。夏枯草主要含有三萜及其苷类、黄酮类、甾醇及其苷类、香豆素、有机酸、挥发油及糖类等成分[5-8]。

夏枯草膏为夏枯草经水加热回流提取制得的单方制剂，由于不同生产企业制备工艺参数差异较大，目前文献中对夏枯草膏提取工艺缺乏研究，多以不同浓度乙醇为提取溶剂，以夏枯草中黄酮类成分为指标进行提取工艺的优化[9-12]。现行标准中缺乏产品质量控制专属性指标，不能对产品原料和成品质量进行有效控制。本研究以夏枯草专属性成分异迷迭香酸苷为指标，采用正交试验法优化夏枯草膏的提取工艺，并为完善夏枯草膏质量标准，建立合理的限度提供技术支持。

1 资料与方法

1.1 仪器与材料

高效液相色谱仪型号岛津LC-20ADXR，紫外检测器型号SPD-20A；电子分析天平型号XS205DU；电子天平型号JY3002；电子分析天平型号BS110S。异迷迭香酸苷对照品（纯度为97.0%，批号：E-3422）；夏枯草由山东广育堂国药有限公司提供（产地为河南），经山东中医药大学石俊英教授鉴定为Prunella vulgaris L.。乙腈、冰乙酸均为色谱纯，水为实验用水。

1.2 分析方法的选择与考察

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Thermo Gold AQ C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm）；以A：乙腈，B：0.5%冰乙酸溶液为流动相，按程序见表1梯度洗脱；检测波长为320nm；流速1.0mL/min；柱温为35℃。理论板数按异迷迭香酸苷峰计算应不低于4000。

表1 流动相梯度洗脱程序

1.2.2 对照品溶液的制备 精密称取异迷迭香酸苷13.94mg，置100mL棕色量瓶中，加70%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10mL，置50mL棕色量瓶中，用70%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。精密吸取对照品溶液10μL，进样，记录色谱图（图1）。

1.2.3 供试品溶液的制备 精密量取夏枯草提取液15mL，置100mL烧瓶中，回收溶剂至干，精密加入70%甲醇50mL，密塞，称定重量，超声处理（功率250W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，作为供试品溶液。精密吸取供试品溶液10μL，进样，记录色谱图（图2）。

图1 对照品溶液的HPLC图

图2 供试品溶液的HPLC图

1.2.4 方法学考察

1.2.4.1 线性关系考察 精密吸取对照品储备液（0.1352mg/mL）各 1、2、3、5、10、15mL,分别置 50mL量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，在上述色谱条件下测定，记录峰面积。以进样量（μg）为横坐标X，以对照品的峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，进行回归处理，得异迷迭香酸苷线性回归方程为：Y=1097 048X-1862（r=1.00，n=6）。结果表明，异迷迭香酸苷在0.0270～0.4057μg范围内，与峰面积线性关系良好。见表2。

表2 线性关系考察

1.2.4.2 精密度试验 精密吸取上述对照品溶液10μL，按上述色谱条件连续进样5次。结果异迷迭香酸苷峰面积的RSD为0.8%，表明仪器的精密度良好。

1.2.4.3 稳定性试验 取同一批供试品溶液，室温放置，分别于 0、2、4、6、8、10、12h 后吸取 10μL 进样测定，结果异迷迭香酸苷峰面积的RSD分别为1.0%，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。

1.2.4.4 重复性试验 按“1.2.3”项下供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，结果异迷迭香酸苷平均含量（mg/g）为0.490,RSD为1.2%，表明该方法重复性良好。

1.2.4.5 加样回收试验 精密加入异迷迭香酸苷对照品溶液2mL（浓度为0.271mg/mL）6份，置平底烧瓶中，回收溶剂至干。精密量取已知含量的同一样品溶液10mL,分别置上述平底烧瓶中，依法制备供试品溶液，测定异迷迭香酸苷含量，计算加样回收率，结果平均回收率为99.2%，RSD为1.2%（n=6）。见表 3。

1.3 夏枯草提取工艺的优化

1.3.1 影响因素水平的选择 在查阅文献资料和实测夏枯草吸水量（为药材的7倍）基础上，选择提取溶剂用量、提取次数、提取时间及浸泡时间为考察的四个因素，考察各因素对提取率影响的主次顺序。见表4。

1.3.2 指标的确认 以夏枯草专属性成分异迷迭香酸苷含量为评价指标。

2 结果

2.1 正交试验结果

依据正交试验L9（34）设计，称取9份药材，每份约10g，参照表5中的因素与水平进行试验，合并每个试验号对应的提取液，过滤，减压浓缩并定容至100mL。测定异迷迭香酸苷的含量，见表5。

表3 加样回收试验（n=6）

表4 正交试验因素水平表

表5 L9(34)正交表实验结果

表6 方差分析表

2.1.1 结果分析 直观分析和方差分析，方差分析见表6。

对表5中的结果进行直观分析可知，影响提取效果的因素顺序B＞D＞A＞C，即提取次数＞浸泡时间＞用水量＞提取时间。最佳工艺为A3B3C2D1，即加12倍量水，药材浸泡1h，提取3次，每次1.5h。

经方差分析，由表6可知A、B、C、D因素对提取效果的影响无统计学意义，考虑到夏枯草药材的吸水量和异迷迭香酸苷的得率，提取条件优化为浸泡1h，提取3次（溶剂用量分别为药材的18倍、10倍、8倍），每次1.5h。

2.1.2 验证试验 称取药材3份，每份约10g，按优化后工艺参数进行提取，测定异迷迭香酸苷的含量。结果含量分别为 0.502、0.506、0.504mg/g，RSD为0.4%。

3 讨论

3.1 提取工艺选择

通过查阅文献,发现夏枯草所含成分以水溶性成分为主,如总黄酮、总酚、总皂苷等，故选择以水作为提取溶剂。综合考虑各成分溶解性能和生产成本,本实验选择用水煎煮的方法进行提取。

3.2 色谱条件的优化

本实验对异迷迭香酸苷含量测定方法进行了优化，由于异迷迭香酸苷含量较低，相邻色谱峰难以分离，参考文献[13-16]中采用 Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（4.6mm×250mm，5μm），流动相为乙腈-1.0%醋酸水溶液，采用梯度洗脱方式，在该色谱条件下，样品中异迷迭香酸苷峰与相邻色谱峰不能达到基线分离。本研究在参考有关文献基础上,采用乙腈-0.5%冰乙酸溶液进行梯度洗脱，异迷迭香酸苷峰与相邻色谱峰达到基线分离，分离度大于1.5，异迷迭香酸苷保留时间为33min。

3.3 正交试验参数和评价指标的选择

通过正交试验法对夏枯草中异迷迭香酸苷的提取工艺进行了优化，得到较为理想的提取条件优化，即浸泡1h，提取3次（溶剂用量分别为药材的18倍、10倍、8倍），每次1.5h，并按照最佳工艺进行了试验，测定的结果平均值高于正交设计表中的最高值，结果表明用该工艺提取夏枯草中异迷迭香酸苷效果较好。同时对夏枯草药材中异迷迭香酸苷的含量进行了测定，为建立夏枯草膏中异迷迭香酸苷的含量限度提供了参考。