乳腺浸润性导管癌中PTEN、EZH2和VEGF的表达及意义

徐小艳，王建君，徐宪伟，冯智坤，门颖丽，杨金花

侵袭和转移是乳腺癌患者死亡的主要原因，乳腺癌浸润和转移的发生机制复杂，其过程涉及众多癌基因和抑癌基因参与。PTEN被认为是一种与肿瘤发生关系密切的抑癌基因，其在正常组织中高表达，在肿瘤中低表达或不表达。EZH2具有组蛋白甲基转移酶的活性，在多种恶性实体肿瘤中高表达，是肿瘤发生、发展过程中的重要促癌基因。VEGF是肿瘤血管生成过程中作用最强、特异性最高的促血管生长因子，与肿瘤的浸润和转移密切相关。目前，PTEN和EZH2在乳腺癌中单独报道较多见，PTEN和EZH2的相关性研究在膀胱癌、前列腺癌、结直肠癌等肿瘤中已有报道，但两者在乳腺癌中的相关性尚未见报道。乳腺癌中PTEN和EZH2表达与VEGF是否存在相关性？由于浸润性导管癌占乳腺癌的大部分，因此本实验采用免疫组化SP法检测96例乳腺浸润性导管癌中PTEN、EZH2和VEGF蛋白的表达，分析PTEN、EZH2和VEGF蛋白与临床病理特征的关系及三者的相关性，丰富和拓展对乳腺癌发生、发展的认识，以期为乳腺癌的治疗和预后提供新的策略。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集郑州人民医院2013年1月～2015年12月存档的96例乳腺原发浸润性导管癌病理活检标本及对应癌旁组织(距离肿块约3 cm)，镜下为正常乳腺组织或良性增生性病变。96例乳腺原发浸润性导管癌患者术前均未接受放、化疗。收集患者相关临床病理资料，按照WHO(2012)乳腺肿瘤病理分级对其进行分组。根据ER、PR、HER-2、CK5/6和EGFR的表达，按照第12届St.Gallen专家共识的乳腺癌分子分型标准：Luminal A型30例，Luminal B型32例，HER-2过表达型24例，基底样型10例。所有标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，并经郑州人民医院病理科确诊。

1.2 主要试剂PTEN、EZH2和VEGF一抗兔抗人单克隆抗体(即用型)、二抗及DAB，均购自福州迈新公司。

1.3 免疫组化免疫组化染色采用SP法：石蜡组织切片、烤片、脱蜡并水化；抗原修复；一抗37 ℃孵育2 h；二抗37 ℃孵育20～30 min；DAB显色5～10 min；脱水、透明和封固。用已知PTEN、EZH2和VEGF阳性的乳腺癌组织和PBS分别代替一抗作为阳性和空白对照。

1.4 结果判断免疫组化判读由两位高年资病理医师采用双盲法进行判读。根据染色强度和染色细胞所占百分比进行半定量判定，其中染色强度分为：阴性(-)，弱阳性(+)，中等阳性()，强阳性()四个等级。染色百分比分为<30%，≥30%且<50%，≥50%。低表达包括阴性(-)、弱阳性(+，无论细胞着色范围)、中等阳性(，细胞着色范围<30%)；高表达包括：中等阳性(，细胞着色范围≥30%)、强阳性(，无论细胞着色范围)。

1.5 统计学分析所有数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，PTEN、EZH2和VEGF表达和临床病理参数的关系采用χ2检验，采用Spearman进行相关性分析，检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌及癌旁组织中PTEN、EZH2和VEGF的表达PTEN主要定位于细胞质，96例乳腺浸润性导管癌中PTEN的阳性率明显低于乳腺癌旁组织(P<0.001)。EZH2主要定位于细胞核，96例乳腺浸润性导管癌中EZH2阳性率明显高于乳腺癌旁组织(P<0.001)。VEGF主要定位于细胞质，96例乳腺浸润性导管癌中VEGF阳性率明显高于乳腺癌旁组织(P<0.001，表1，图1)。

ABCDEF

表1 乳腺癌和癌旁组织中PTEN、EZH2和VEGF的表达[n(%)]

2.2 乳腺癌中PTEN、EZH2和VEGF表达与临床病理特征的关系96例乳腺浸润性导管癌中，PTEN、EZH2和VEGF表达均与分化程度、淋巴结转移及TNM分期均有关(P均<0.05)。此外，VEGF与患者年龄有关，其在年龄<50岁组的阳性率较高(P<0.05，表2)。

表2 乳腺浸润性导管癌中PTEN、EZH2和VEGF表达与临床病理特征的关系

2.3 PTEN、EZH2和VEGF表达的相关性96例乳腺浸润性导管癌组织中，PTEN和EZH2同时高表达者27例，同时低表达者8例，仅PTEN高表达者30例，仅EZH2高表达者31例，Spearman相关性分析结果显示：PTEN与EZH2表达呈负相关(r=-0.323，P<0.001)。PTEN和VEGF同时高表达者30例，同时低表达者5例，仅PTEN高表达者27例，仅VEGF高表达者34例，Spearman相关性分析结果显示：PTEN与VEGF表达呈负相关(rs=-0.360，P<0.001，表3)。

表3 乳腺浸润性导管癌中PTEN、EZH2和VEGF表达的相关性

2.4 PTEN、EZH2和VEGF表达与乳腺癌分子亚型的关系PTEN表达与乳腺癌分子亚型有关，其在Luminal A和Luminal B型乳腺癌中有较高的阳性率(分别为22/30，26/32)，在HER-2过表达型和基底样型乳腺癌中阳性率较低(分别为6/24、3/10)，差异有统计学意义(χ2=24.106，P<0.001)；EZH2蛋白在HER-2过表达型和基底样型乳腺癌中阳性率较高(分别22/24、8/10)，在Luminal A和Luminal B型中阳性率较低(10/30、18/32)，差异有统计学意义(χ2=20.838，P<0.001)；VEGF蛋白在HER-2过表达型和基底样型乳腺癌中阳性率较高(分别为21/24、8/10)，在Luminal A和Luminal B型中阳性率较低(12/30、22/32)，差异有统计学意义(χ2=14.878，P=0.002)。PTEN、EZH2和VEGF在Luminal A和Luminal B型中的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)，PTEN、EZH2和VEGF在HER-2过表达型和基底样型乳腺癌中的阳性率差异均无统计学意义(P>0.05，表4)。

表4 PTEN、EZH2和VEGF表达与乳腺癌分子分型的关系

3 讨论

随着对肿瘤基因研究的不断深入，人们对乳腺癌的发病机制有了进一步的认识，乳腺癌的发生、发展和预后并不是单个分子事件，而是涉及多个促癌基因和抑癌基因异常表达，如HER-2、p53等基因[1-2]。PTEN、EZH2和VEGF作为调控细胞生长、凋亡、侵袭和转移的关键基因，大量研究表明其与肿瘤浸润转移密切相关。

PTEN基因作为一种抑癌基因，能够负性调节细胞生长，诱导凋亡并抑制细胞浸润、转移。其在乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等多种肿瘤中发现存在基因突变。本实验中PTEN蛋白在乳腺癌旁组织中阳性率低于乳腺癌组织，其表达与分化程度、淋巴结转移及TNM分期有关，PTEN表达在预后较好的Luminal A和Luminal B型乳腺癌中有较高的表达，表明PTEN表达能够在一定程度上反应肿瘤的发生、发展，与李新军等[3]报道的结果一致。

EZH2作为一种癌基因，与肿瘤浸润、转移和预后相关。国外有研究发现EZH2在正常乳腺上皮细胞表达缺失，在乳腺导管原位癌中表达开始增加，其在浸润性导管癌中表达明显增加[4]。Inari等[5]的研究显示乳腺癌组织标本中EZH2阳性率56.3%，本组96例乳腺浸润性导管癌组织中EZH2阳性率为83.33%，明显高于以往文献报道。原因可能如下：(1)样本含量不同；(2)采用的标本组织学类型不同，以往研究的乳腺癌组织学类型多样包括浸润性导管癌、浸润性小叶癌，而本实验只涉及乳腺浸润性导管癌。本组实验发现有淋巴结转移、低分化及pTNM分期越高者，EZH2表达增加；EZH2表达在HER-2过表达型和基底样型乳腺癌中表达较高，提示EZH2高表达在一定程度上反应了乳腺癌发生、发展。

肿瘤的生长、浸润和转移离不开新生毛细血管的形成。VEGF能够作用于血管内皮细胞，促进细胞分裂和毛细血管出芽生长，为肿瘤的增殖和转移提供相对有利的微环境[6-7]。本实验结果显示，VEGF与乳腺浸润性导管癌组织学分级、淋巴结转移、pTNM分期均有关，提示VEGF高表达促进了乳腺癌浸润和转移。本实验VEGF在乳腺癌中的表达与以往文献报道基本一致，有所不同的是本实验中VEGF与肿瘤患者的年龄相关，其在年龄<50岁组的阳性率较高，推测年轻患者机体代谢旺盛，其肿瘤组织中VEGF表达较高，可以作为后续分析的切入点。

PTEN和EZH2在前列腺癌、结肠癌等中表达的相关性已有文献报道[8-9]，两者均呈负相关，但两者在乳腺癌中的相关性研究尚未见同类报道。本实验中相关分析结果显示，96例乳腺浸润性导管癌中PTEN和EZH2呈负相关，研究结果还表明乳腺癌中PTEN和VEGF呈负相关。众多研究表明，抑癌基因的抑癌作用以及癌基因的致癌作用不仅仅是某个基因的行为，而是多个基因表达共同协作的结果。通过查阅文献，我们得知PTEN蛋白表达降低可使细胞间的黏附力下降，上调MMP和VEGF的表达，进而促进肿瘤细胞的浸润以及肿瘤血管形成[10]。EZH2高表达则能够上调MMP和VEGF的表达，促进肿瘤细胞的浸润、转移和肿瘤血管的形成[11-12]。进一步文献研究表明，PTEN可以通过抑制MAPK/ERK信号通路来发挥肿瘤抑制作用[13]，EZH2则可以通过激活MAPK/ERK信号通路促进肿瘤进展[14]。根据本实验结果显示，推测在乳腺癌中PTEN失表达和EZH2过表达可能会导致MAPK/ERK信号通路显著激活，上调VEGF的表达，从而促进肿瘤的发生、发展。本实验不足之处在于仅从蛋白水平分析了三者的相关性，其具体分子作用机制有待进一步分析。

综上所述，PTEN蛋白在乳腺良性增生性病变及正常组织中高表达，乳腺浸润性导管癌中低表达，其低表达提示组织学分化差及淋巴结易转移，其在Luminal A和Luminal B型中有较高的表达。EZH2和VEGF蛋白在乳腺良性增生性病变及正常组织中几乎不表达，乳腺浸润性导管癌中高表达，蛋白水平表达越高，组织学分化越差，肿瘤分期越高，淋巴结容易转移，其在HER-2过表达型和基底样型中表达较高。乳腺浸润性导管癌中PTEN蛋白和EZH2及VEGF蛋白呈负相关，三者可能通过相同的信号通路共同作用，促进了乳腺癌的发生、发展，其分子机制有待进一步分析。