有机化学物质碳氮稳定同位素系列标准物质研制

李科， 张琳， 刘福亮， 贾艳琨

(自然资源部地下水科学与工程重点实验室， 中国地质科学院水文地质环境地质研究所，河北 正定 050803)

碳、氮元素作为生物生存必须的元素，是组成生态系统的骨架。天然体中存在着大量碳、氮元素及其化合物，随着物理和化学作用等天然条件的改变，引起它们的同位素比微量改变即同位素分馏，这种微量变化是认识天然体中物质变化的最好信息。稳定碳同位素广泛应用于探讨各种生态环境中的物质来源和迁移规律[1-3]，氮同位素则反映了不同物源的贡献[4-5]，作为生态环境研究的示踪剂，碳、氮同位素可以提供非常重要的信息及人类活动记录，在水中颗粒物、污泥、海洋沉积物、植物、土壤、第四纪等领域的研究愈加广泛[6-12]。碳、氮稳定同位素的分析已越来越广泛地用于同位素化学、生物化学、环境科学、地球化学、矿物学和宇宙化学等[13-17]。

碳、氮同位素国际标准物质由国际原子能机构(IAEA)研制并向世界范围内的相关实验室发放，因其制备数量有限，几种主要碳氮同位素国际标准物质现已耗尽，IAEA倡导各国研制与国际标准相联系的自己国家的同位素标准物质，美国、日本[18]等很多国家都研制了与国际标准VPDB和Air-N2相联系的碳、氮同位素标准物质，满足本国科研需求。在我国有证标准物质中，20世纪80年代末期由中国石油勘探开发科学研究院研制了炭黑国家一级标准物质(GBW04407、GBW04408)，用于有机质碳同位素的测定。炭黑由近乎100%纯碳组成，更适用于石油等领域高碳含量样品测试。而环境中复杂成分的有机物质，由于其碳含量(如土壤、沉积物等样品)相对较低，之前的国家标准物质已经不能满足当前各实验室生态环境样品研究需求。随着实验仪器的发展进步，碳、氮同位素可以同时检出，而我国尚无氮同位素标准物质，研制与国际标准VPDB和Air-N2相联系的碳、氮同位素标准物质成为我国同位素技术应用工作所面临的一项紧迫任务。

国际上新近开展的同位素标准研制工作，皆使同位素组成形成系列，且差别更小，以提高量值传递精度。根据国际同位素研究学科发展趋势和有机质碳氮同位素标准物质研究现状，本项目组按照我国环境样品中碳氮稳定同位素含量范围[6-8]，完成了涵盖我国天然环境碳氮稳定同位素端值的呈梯度分布的4个有机质碳、氮同位素标准物质，采用目前国际广泛应用的高温燃烧-气体同位素质谱法在线连续流分析技术[19-21]，开展均匀性、稳定性检验及定值，以适应新方法新技术的需求，满足不同环境样品碳、氮稳定同位素分析研究需求。

1 实验部分

1.1 候选物的采集和制备

本次标准物质与国际标准相联系，所选的候选物包括了物理性质不同的易溶于水的尿素和微溶于水的L-谷氨酸，两种有机物在室温条件下非常稳定。选择的有机质稳定、均匀，有足够量，能够保证长期保存，两种有机物C与N摩尔比不同，可满足不同生态样品分析需求。

根据生态系统中碳、氮同位素值组成的区间值δ13C值为-40‰～0‰，δ15N值为-10‰～30‰，确定了本项目研制的系列碳氮同位素标准物质同位素值区间。通过对大量商用试剂候选物的测试，筛选出处于δ13C、δ15N负端值的尿素、L-谷氨酸商用分析纯作为2个候选物(表1)，通过添加高富集的δ13C、δ15N尿素纯品，人工配制另两种尿素，由此组成呈梯度分布、满足不同特征值需求的系列(4个)有机物同位素标准品。

表1 碳氮同位素标准物质候选物设计Table 1 Design of candidates for carbon and nitrogen isotopes reference materials

1.2 候选物分装

在分装标准前对小瓶进行洗涤(酸洗、水洗)，烘干，灭菌。在尽可能短的时间内将样品分装于洁净的小玻璃瓶中，每瓶装1g，每种标准样品分装1000瓶，从001～1000逐瓶编号。封口后全部样品放置在装有硅胶的干燥器中保存，干燥器放置于避光处长期保存。

2 候选物均匀性和稳定性检验

2.1 候选物均匀性检验

每种标准物质随机抽取25瓶的均匀性子样，包括子样中最可能产生污染的分装过程的前5瓶，然后再随机抽取子样20瓶，每份子样做双份分析。δ13C、δ15N值选择经典的高温燃烧-气体同位素质谱法进行样品的均匀性检验，按照《标准物质定值的通用原则及统计学原理》(JJF 1343—2012)对测试结果进行方差(单因素F检验法)检验，4种标准物质的均匀性检验得到的F值都小于相应的自由度的临界值，测试结果(表2)显示4种标准物质候选物的均匀性良好。

表2 候选物δ13C和δ15N值的均匀性检验方差分析结果Table 2 Variance analysis for δ13C and δ15N values homogeneity inspection of reference materials

2.2 候选物稳定性检验

标准物质的稳定性包括短期稳定性和长期稳定性。为了获得具有良好稳定性的标准物质，本次研制的系列标准物质的初始阶段注意选择了具有稳定性能材料作为标准物质的候选物[22-23]，《标准物质定值的通用原则及统计学原理》(JJF 1343—2012)中5.1短期稳定性评估通常在不同温度条件下进行，以考察温度对于标准物质待定特性值的影响，此次选择将4种标准物质在不同温度(4℃、20℃、35℃、50℃、60℃)下，进行样品δ13C和δ15N测定。经检验，环境温度对δ13C和δ15N值无影响，因此本次研制的标准物质可保证标准物质在温度、运输过程中的短期稳定性。

4种标准物质依据JJF 1343—2012中5.2要求，进行了长期稳定性的研究。在本项目实施的近两年过程中，结合定值采用高温燃烧-气体同位素质谱法进行了5次δ13C和δ15N稳定性检验，由稳定性测试结果(表3)表明，本项目研制的标准物质候选物是稳定的。

表3 候选物δ13C和δ15N值的稳定性检验结果Table 3 Results of for δ13C and δ15N values stability inspection of standard materials

3 特征量值分析及定值

3.1 定值溯源性

本次标准物质量值的定值，采用多个实验室采用一种或多种准确、可靠的方法协作测定，强调每个环节的量值溯源性，并且利用一切技术手段及组织手段确保分析数据的准确度和可靠性。测量δ13C值时，以国际标准IAEA-CH-6、USGS40、USGS41、L-SVEC为测量尺度。测量δ15N值时，以国际标准USGS40、IAEA-N-1、IAEA-N-2、USGS41为测量尺度，采用线性校正[24-26]所定出的δ值就是相对于国际标准VPDB和Air-N2的值。

3.2 定值实验室

经过对行业代表性、实验室技术能力及设备条件等进行综合考虑，本次标准物质定值，经过前期的盲样考核后确定了包括研制单位实验室在内的12家实验室分别参与协同定值，参加协同定值的实验室为(实验室编号依次为1～12)：加拿大渥太华大学稳定同位素实验室(University of Ottawa G.G.Hatch Stable Isotope Laboratory)，中国科学院地质与地球物理研究所，河海大学，国家海洋局杭州海洋二所，国家海洋局杭州海洋三所，中国地质科学院青岛海洋地质研究所，中国科学院东北地理与农业生态研究所，英国Iso-Analytical同位素分析研究中心(Iso-Analytical Stable Isotope Ratio Analysis Laboratory)，英国苏格兰大学(Scottish Universities Environmental Research Centre)，中国地质调查局南京地质调查中心，中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所。

3.3 定值元素δ13C的测量方法及结果

本次δ13C值的定值测定是以经典的高温燃烧-气体同位素质谱法进行测试，各实验室的测试仪器不同。根据Reference materials—General and statistical principles for certification(ISO Guide 35)和《标准物质定值的通用原则及统计学原理》(JJF 1343—2012)规定，δ13C定值实验组数为10组(表4)。

表4 各实验室δ13C值的分析方法和分析数据Table 4 Multiple measurement data of δ13C for the four reference materials

3.4 定值元素δ15N值的测量方法及结果

本次δ15N值的定值是采用经典的高温燃烧-气体同位素质谱法进行测试，各实验室的测试仪器不同。根据 ISO Guide 35和JJF 1343—2012规定，δ15N定值实验组数为12组(表5)。

表5 各实验室δ15N值的分析方法和分析数据Table 5 Multiple measurement data of δ15N for the four reference materials

3.5 数据处理

本次标准物质以组均值为基础，整理各协作实验室报出的数据，按标准物质数据处理的模式[27-32]：①分别采用狄克逊法(Dixon)和格拉布斯法(Grubbs)同时进行离群值检验，两种方法检验均为离群值则予以剔除；②采用夏皮罗-威尔克法(Shapiro-Wilk)检验数据正态性；③采用科克伦法(Cochran)检验各组数据之间是否等精度。经检验研制的4个碳氮同位素标准物质正态检验值W均大于置信概率95%的列表值，剔除后的定值测试数据均呈正态分布。

3.6 不确定度计算与评估

《标准物质定值的通用原则及统计学原理》(JJF 1343—2012)明确了标准值的总不确定度由三部分组成。第一部分是标准物质定值过程带来的不确定度uchar，包括：①定值数据平均值的不确定度uA，由定值实验室间的标准偏差、测量次数及所要求的置信水平按统计方法计算得出；②对测量的其他一些影响因素作出分析估算出其大小uB。第二部分是物质的不均匀性引起的不确定性估计ubb；第三部分是物质在有效期内的变动性所引起的误差uS；这三部分不确定度的合成不确定度为标准物质的总不确定度。现简要分析如下。

(1)分析测量的引起的A类不确定度和B类不确定度

本次标准物质是由多个实验室使用一种准确可靠的方法协同进行定值。测量数据经正态分布检验分析得出各组数据呈正态分布。因此以算术平均值作为最佳估计值(标准值)；A类不确定度为平均值的不确定度，以各实验室定值数据平均值的标准偏差、测量次数及95%的置信水平算得，作为第一部分不确定度的估算值(包含了样品分馏、测量全过程的误差)。按照算术平均值的不确定度公式(1)进行计算：

(1)

式中：s—实验室平均值数据间的标准偏差；n—实验室平均值数据个数。

标准不确定度B类评定是通过借助可利用的相关信息，进行科学分析判断而得到的标准偏差，经分析判断得到的标准偏差，得出不确定度的B类判定分量。本次定值过程中样品和国际标准物质均使用相同原理方法及仪器进行测量，样品通过线性校正得到定值结果。本次B类不确度来源主要来自两方面：由国际标准物质本身不确定度引入的不确定度和标准曲线拟合中数据对非线性的不确定度。

(2)不均匀性引起的不确定度

前已述及，通过均匀性检验证明4种标准物质均匀性良好，这里应用ISO35导则中数学统计方法进一步对不均匀性引起的不确定度进行分析。样品组间不均匀性引起的标准偏差为MSamong，组内不均匀性引起的标准偏差为MSwithin，样品不均匀性引起的不确定度(uhom)由公式(2)进行计算。

(2)

(3)不稳定性引起的不确定度

4种标准物质的特征量值稳定性数据中无可观察到的趋势。按照导则ISO35中8.5方法，选择了通过斜率为零的回归直线的不确定度估计稳定性的不确定度ults，在给定的时间t内没有显著降解的情况下，采用公式(3)计算由于样品不稳定引起的不确定度：

ults=sb×t

(3)

(4)扩展不确定度

标准物质测量的扩展不确定度UCRM为定值测量不确定度uchar、均匀性引起的不确定度ubb、稳定性引起的不确定度ults对特征值总不确定度的贡献来计算，见公式(4)。当对应的置信水平为95%时，包含因子k=2，不确定度的修约是只进不舍。最终的定值结果列于表6。

表6 定值元素δ13C和δ15N认定值及扩展不确定度Table 6 δ13C and δ15N ceritified values for materials GBW04494 to GBW04497 and their associated expanded uncertainties (k=2)

(4)

4 结论

本文报道了获批的有机质碳氮同位素国家一级标准物质(GBW04494～GBW04497)研制过程。本次研制的标准物质是基于研制单位多年实验积累的数据和天然环境样品中碳、氮同位素含量组成，参照国际已研制的稳定碳氮同位素标准物质，研制完成的呈梯度分布、认定值区间范围大的系列标准物质，其δ13C值为-45.60‰～2.16‰，δ15N值为-7.51‰～33.75‰，δ13C的定值扩展不确定度≤0.08‰，δ15N的定值扩展不确定度≤0.09‰，定值水平与国际标准物质相当。

该系列标准物质已供地质及环境部门分析监控、仪器校准、方法评价、质量保证和质量监控，为我国多家实验室提供了测试溯源保障，为地质调查工作提供了技术支撑。同时该系列标准物质推动了同位素水文、环境学等相关学科研究工作的进展，也为本项目组后期进行其他稳定同位素标准物质的研制积累了宝贵的经验。