大鼠颅脑损伤后差异表达基因及miRNA研究

王家昕，王晓霞，李 洁，苗泽远，倪 爽，王子钰，苏立宁

(河北北方学院 基础医学院，河北 张家口 075000)

创伤性脑损伤(Traumaitc brain injury, TBI)是外科常见的疾患，严重影响人们健康和正常生活，致死和致残率极高。TBI发病机制非常复杂，相关文献表明，TBI是一个十分复杂的过程，需要多分子参与及相互作用。因此我们利用多种现代生物学手段及统计学处理方法，得到大鼠颅脑损伤后基因及miRNA表达差异，为临床诊断及治疗TBI提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 筛选差异表达基因

在基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus)搜索并下载基因表达谱GSE111452和miRNA表达谱GSE59646，利用GEO2R筛选关于大鼠脑损伤24 h后基因和miRNA的差异表达数据(P值及FDR值均≤0.05)，再利用MiRwalk软件对筛选miRNA的靶基因进行预测，将靶基因与差异基因进行比较，保留重叠的差异表达基因(Differentially expressed genes，DEGenes)。

1.2 DAVID做差异表达基因的本体论功能富集分析

DAVID做基因本体论功能富集分析，从生物学过程(Biological process，BP)、细胞成分(Cell components，CC)及分子功能(Molecular function，MF)方面，对这些基因的功能进行描述。筛选标准为P≤0.05。

1.3 Cytoscape软件构建miRNA-DEGenes网络图

利用Excel软件得出关于筛选出的miRNA和差异表达基因的上调和下调结果(根据logFC值得出上调和下调结果)，并将其结果导入Cytoscape软件生成miRNA-DEGenes网络图。

2 结 果

2.1 大鼠脑组织基因及miRNA表达变化

用GEO2R筛选关于大鼠脑损伤24小时后基因和miRNA的表达数据(P值及FDR值均≤0.05)，得到247个相对明显的差异表达的基因，包括150个上调表达基因和97个下调表达基因；7个差异表达的miRNA，包括2个上调表达miRNA和5个下调表达miRNA。将差异基因与靶基因对比后，可得到48个重叠基因。

2.2 差异表达基因的本体论功能富集分析

在DAVID软件中进行基因的本体论功能富集分析GO发现，差异表达基因中，NES、CCL2、PLIN2、 LGALS1等13个基因在药物应答(Response to drug)的生物学进程中起作用，CXCL1、CALCA、S1PR3等12 个基因在炎症反应(Inflammatory response)的生物学过程中起作用，CXCL1、 CCL2、RELT等10个基因在对脂多糖的反应(Response to lipopolysaccharide)中发挥作用。根据P值大小，BP富集结果前20名P值对数大小结果(见图1)。

图1 差异表达基因GO功能富集-生物学过程BP结果Fig.1 Biological process results of GO function enrichment of differentially expressed genes

差异表达基因在细胞质(Cytoplasm)、胞外外体(Extracellular exosome)、细胞外间隙(Extracellular-space)等处发挥作用。根据P值大小，CC富集结果前20名P值对数大小(见图2)。

图2 差异表达基因GO功能富集-细胞成分CC结果Fig.2 Cell components results of GO function enrichment of differentially expressed genes

差异表达基因在钙离子结合(Calcium ion binding)、钙黏蛋白结合参与细胞间粘附(Cadherin binding involved in cell-cell adhesion)、蛋白域特异性结合 (Protein domain specific binding)等分子功能中起作用。根据P值大小，MF富集结果前20名P值对数大小(见图3)。

图3 差异表达基因GO功能富-分子功能MF结果Fig.3 Molecular function results of GO function enrichment of differentially expressed genes

2.3 重叠基因及其对应的miRNA

在上述分析中，将靶基因与差异基因比较得到48个重叠基因，包括14个下调基因以及34个上调基因。为了更直观清楚地看到重叠基因与其对应的miRNA的关系，将重叠基因、miRNA及其上下调结果导入cytoscape软件，得到miRNA-DEGenes网络图(见图4)。

3 讨 论

20世纪80年代以来，随着医疗技术的发展及人类急救意识的增高，各项急救指南的不断健全与完善，大大提高了创伤性脑损伤的救治水平和救治成功率。现阶段，对于创伤性脑损伤的发病机制及病理生理的研究逐渐成熟起来[1]。

3.1 创伤性脑损伤与炎症反应有着密切联系

研究发现，创伤性脑损伤破坏了血脑屏障，从而导致了炎症反应的发生。在差异表达基因GO功能富集-生物学过程BP分析结果中，趋化因子CCL和CXCL基因高表达，如CCL2、CXCL1、CXCL13等基因。趋化因子是细胞分泌的微细胞因子或信号蛋白，它们被称为趋化因子，因为它们可以诱导邻近反应性细胞的趋化。研究表明，趋化因子在中枢神经系统中表达。脑组织在创伤性脑损伤后发生缺血缺氧，导致部分趋化因子表达上调，如单核细胞趋化因子- l(Monocyte chemoattractant protein, MCP- I )/CCL2、单核细胞趋化因子-2(Monocyte chemoattractant protein，MCP-2)/CCL8、巨噬细胞炎性因子-1α(Macrophage inflammatory protein，MIP-1α)/CCL3、白介素-8(Interleukin，IL-8)/CXCL8(分泌趋化因子的细胞有受损的神经元细胞、小胶质细胞、星形角质细胞等)[2]。这些趋化因子的高表达进一步促进了炎症反应的发展。随着血脑屏障的进一步破坏，血液循环中的巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞进入破坏的脑组织。多个临床试验表明，炎症反应的发展与脑损伤后继发的局部神经组织变性坏死、脑血流自身调节功能的改变、血脑屏障通透性改变及血管性和细胞毒性脑水肿的发生、损伤区域神经组织生化代谢的紊乱和神经递质的变化以及脑组织的修复有着极大的关系[3]。

图4 重叠基因及其对应miRNAFig.4 Overlapping genes and corresponding miRNA

3.2 miRNA参与调控TBI后的细胞凋亡

在上述论述中，可发现颅脑损伤后引起神经细胞的炎症反应和水肿，进而引起细胞凋亡，加重创伤性脑损伤的程度。研究发现，创伤性脑损伤后大鼠大脑皮质中上调的miRNA有miRNA-23a、miRNA-27a; 有些促凋亡蛋白因子也上调，如noxa、puma、Bax, BH3-only等因子，这说明miRNA-23a、miRNA-27a 等miRNA对创伤性脑损伤后的细胞凋亡起调控作用，对神经细胞修复起着负向调控的作用[4]。本研究发现，趋化因子CXCL13高表达，其对应的miRNA-346却下调，导致大量细胞凋亡。同时有研究发现，在创伤性脑损伤大鼠神经元细胞模型中miRNA-22表达下调，乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase，LDH)含量增加，蛋白酶caspase3 活性也增强，人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因(Phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN )以及蛋白激酶B(ProteinKinaseB，AKT)即凋亡基因蛋白水平增加、而且对抑制凋亡蛋白如Bcl-2和Bcl-w起着负向调控的作用，这提示下调的miRNA-22可能会通过参与调控PTEN/AKT信号通路，来对神经细胞的凋亡起促进作用[5]。通过图4可发现，Cxcl13、F13al、Serpine1、Melk、Dtl、Rab7b、Rcc2等多种基因高表达，而靶标miRNA-346下调，猜测它们共同调控细胞的凋亡。通过上述多项研究，发现miRNA极大可能参与调控TBI后的细胞凋亡。

3.3 miRNA参与调节创伤性脑损伤后突触的可塑性

突触可塑性是学习记忆细胞的生物学基础，在神经系统发育中起着重要的作用。越来越多的研究资料显示，miRNA参与调节创伤性脑损伤后突触的可塑性。在孙婷怡，刘良等[6]人的研究中发现作用于大鼠海马神经元树突棘的miRNA-134在调控树突棘的大小中起着负性调控作用。miRNA-134通过抑制LIM 结构域蛋白激酶 1 ( Lim-domain containing protein kinase 1，LIMK1) 的翻译，在不影响树突棘的数量下使其大小受到限制，在突触传递中发挥负调控作用[7]。突触受到刺激，会释放脑源性神经营养因子( Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)，脑源性神经营养因子作用于相应的受体之后，阻断了对miRNA-134 的抑制作用，增加了树突棘数目。Griesbach 等已检测到大鼠创伤性脑损伤后，BDNF 表达量上调，由此推测 miRNA-134 可能参与导致创伤性脑损伤后认知功能障碍[8]。研究发现，Sdc4、Chdh、S1pr3、Cd44、Maff等基因高表达，但对应的miRNA-134-5P下调，由此推测这些高表达的基因抑制miRNA-134-5P表达，从而导致创伤性脑损伤后认知功能障碍。另外，有一项研究发现，Rho家族的一种GTP酶激活蛋白p250GAP，可与多种突触蛋白发生作用并水解下游底物上的GTP，并激活与底物相关的信号通路，最终破坏突触结构骨架，减小树突棘的密度及体积[9]。Gu等用强直刺激引诱大鼠海马区谢佛侧枝产生长时增强效应(Long term potentiation,LTP)后发现miRNA-26a和miRNA-384-5p的水平下降，经过预测和实验验证，发现miRNA-26a和miRNA-384-5p参与凋控RSK3基因的表达。在抑制LTP过程中的RSK3的活性后，发现海马区的海马回的场兴奋性突触后电位( Field excitatory postsynaptic potential，fEPSP)显著增强，因此推断RSK3在LTP中扮演着重要角色，miRNA-26a和miRNA-384-5p通过调控 RSK3参与了调节突触的可塑性[10]。有研究显示，抑制 miRNA-9-3p的表达后，与LTP负相关的基因Dmd、SAP97表达升高[11]。研究发现miRNA-26a，miRNA-384-5p和miRNA-9-3p可通过调节LTP影响突触可塑性的发生发展。

3.4 控制炎症反应和miRNA成为治疗TBI的新靶点

以往研究资料发现，创伤性脑损伤后血脑屏障破坏，同时大量的炎症因子炎症细胞进入脑循坏中导致细胞坏死，神经组织受到破坏，脑组织发生一些不可逆的损伤，所以如何控制炎症反应的发展，减少细胞的损伤与死亡是今后研究创伤性脑损伤的重点。在上述结果中，我们发现大量的趋化因子和其他炎症因子过度表达，最终导致了炎症的级联反应，因此如何控制炎症因子及其相关基因的表达是今后探索的方向之一。

创伤性脑损伤中针对炎症反应的治疗还有许多不同的手段，所应用的药物绝大部分为抗炎药物或者免疫抑制剂，比如糖皮质激素、非甾体类抗炎药，他汀类药物和特定的细胞因子抑制剂，在不同的创伤性脑损伤动物模型的实验研究中，这些药物在神经保护方面都发挥着比较好的作用[12]。在创伤性脑损伤的治疗中，黄体酮也是应用较多的一种药物，在进行反复的基础研究并结合一些临床随机对照实验后，发现黄体酮在创伤性脑损伤后早期的炎症反应方面有较好的治疗作用，可以恢复患者的神经功能[13]。Zheng等在纳入了6项大型临床随机对照试验的系统评价中却指出，在创伤性脑损伤6个月后对患者的预后进行评估，并未发现黄体酮和安慰剂对照组在死亡率或神经功能预后上有明显的差异[14]。上述研究发现，运用抗炎药物抑制创伤性脑损伤后的炎症反应并不都具有良好的治疗作用。通过药物控制炎症反应治疗创伤性脑损伤表现出了二重性。

而基于一些miRNA导致创伤性脑损伤后认知功能出现障碍的发现，为今后创伤性脑损伤的治疗提供了新的方向。研究资料显示，Ge等给创伤性脑损伤大鼠模型的脑室内输注miRNA-21 mimics，发现大鼠脑组织水肿得到不同程度的缓解，病灶面积减少，细胞凋亡改善等[15]。因此抑制或促进某些miRNA的表达是治疗创伤性脑损伤的新靶点。

4 结 论

1)创伤性脑损伤后，可引起多个基因的表达发生变化，而这些差异表达基因在生物学过程、分子功能、细胞学组分等方面发挥着重要作用。

2)创伤性脑损伤与炎症反应有密切的关系，脑损伤后可引起炎症的级联反应，趋化因子和其它炎症因子的表达也发生变化。因此如何控制炎症因子及其相关基因的表达是今后探索的方向之一。

3)创伤性脑损伤后，重合基因和对应的miRNA分别发生着上调或是下调的不同变化，这些基因和miRNA的变化可能是介导创伤性脑损伤后人体各个功能发生障碍的关键靶点，比如一些miRNA参与调节创伤性脑损伤后突触的可塑性。因此，对其深入研究，能够为治疗创伤性脑损伤提供新的诊断和治疗依据。