IgA 肾病患者与膜性肾病患者外周血单核细胞mRNA分析

梁 爽，凡 奎，张 燕，谢杨眉

(四川省三台县人民医院 肾内科，四川 绵阳 621100)

IgA肾病(IgA Nephropathy，IgAN)是最常见的原发性肾小球肾炎，20%～40%的患者在20年内进展为终末期肾病[1]。膜性肾病(Membranous Nephropathy,MN)是肾病综合征常见的病理类型之一。经肾脏活检可确切诊断和鉴别IgAN和MN，但肾穿为有创检查，存在不易操作等因素。因此，了解 IgAN 和MN的疾病发生发展机制以及寻找特异性生物标记物，能为诊断和鉴别提供简便、可靠的依据补充。

运用传统的研究方法和数据处理分析方式常遇见高维度、小样本、变异大、线性等问题, 不易做到简便的分类和有效的、系统的分析。生物信息学技术通过综合利用生物学、计算机科学和信息技术等多学科技术、手段，能够精确高效的运算大量、复杂的生物数据。通过下载IgAN和MN患者外周血单核细胞DNA高通量数据集，分析筛选关键基因和途径，进行基因本体(Gene Ontology，GO)功能、京都基因基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genome，KEGG)和显著富集基因蛋白质与蛋白质相互作用(Protein-Protein Interaction，PPI)分析等进一步了解差异表达基因(Differentially Expressed Genes,DEGs)。

1 材料与方法

1.1 GEO数据库芯片数据下载

进 入NCBI Gene Expression Omnibus(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，下载GSE73953数据集，该数据集包含 15个IgAN样本和8个MN样本。下载其矩阵文件 SOFT formatted family file(s).SOFT 以及原始数据 GSE73953_RAW.tar。通过GEO数据库评价数据原始值分布。

1.2 方法

1.2.1 筛选差异表达基因(DEGs)

R是集统计分析与图形显示于一体的一种统计分析软件。它拥有一套完整的数据处理、计算和制图软件系统。其主要功能包括：数据存储、数组运算、统计分析、统计作图和程序编写等。

下载安装R软件。加载limma包[2]，对原始数据进行提取和处理，以及差异表达基因的分析(|LogFC|>2,P<0.05)。R软件采用R/Bioconductor software version 3.5.1版本。

1.2.2 差异表达基因GO和KEGG分析

运用Cytoscape(https://cytoscape.org/),安装bingo，将筛选出的前96个差异表达基因导入程序，根据GEO中数据研究对象，选择Homo sapiens。

运用DAVID数据库(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery, https://david.ncifcrf.gov/)对差异表达基因进行GO富集分析和KEGG通路分析。Corrected P-Value<0.05 记为有统计学意义。

1.2.3 显著富集差异表达基因PPI分析

STRING(Search Tool for the Rtrieval of Interacting Genes，https://string-db.org/)是已知和预测蛋白质-蛋白质相互作用的数据库。相互作用包括直接(物理)联系和间接(功能)联系。它们来源于计算预测、生物体之间的知识转移以及来自其他(主要)数据库的相互作用。

运用STRING在线数据库，构建蛋白质互作网络，取combined score≥0.4，下载PPI网络数据。通过Cytoscape软件(version 3.6.1)将PPI网络可视化，并通过MCODE插件聚类构建共表达模块。最后，通过R软件计算PPI 网络中各个节点的连接度。运行后得到蛋白质相互作用关系图。

2 结果分析

2.1 GEO数据库芯片数据

数据来自GEO数据库GSE73953数据集，下载得到15个IgA Nephropathy样本和8个Membranous Nephropathy样本。得到矩阵文件SOFT formatted family file(s).SOFT 以及原始数据 GSE73953_RAW.tar。通过GEO数据库GEO2R评价数据集原始值分布(见图1)，基本以中间值为中心表明数据具有可比较性。

2.2 差异表达基因(DEGs)

该数据集包含15个IgA Nephropathy样本和8个Membranous Nephropathy样本。通过R软件limma包[2]，根据限定条件：|LogFC|>2,P<0.05，在IgAN患者和MN患者中得到显著差异表达基因75个，其中73个上调表达基因和2个下调表达基因。由差异表达基因所得热图(见图2a)和火山图(见图2b)。

2.3 差异基因GO和KEGG分析

为进一步了解筛选得到IgAN、MN疾病相关的差异表达基因功能和通路，利用 Cytoscape和DAVID在线数据库对分析得到的差异基因分别进行GO富集分析与KEGG通路分析。

显著富集差异表达基因GO富集分析的生物学过程(Biological process，BP)(见图3a)主要包括蛋白质转运、内溶酶体到溶酶体转运、趋化因子介导的信号通路作用和钙介导信号的调控等。细胞学组分(Cellular components，CC)(见图3b)主要为COPⅡ囊泡、NMDA选择性谷氨酸受体复合物和高尔基体等。分子生物学功能(Molecular function，MF)(见图3c)主要有NMDA谷氨酸受体激活、信号传感器激活和钙粘蛋白结合参与细胞与细胞的黏附等。

显著富集差异表达基因KEGG通路分析(见图3d)显示具有统计学差异(P<0.05)的上调及下调差异表达基因通路，包括Endocytosis和Hepatitis B的相关信号通路。

图1 原始数据集值分布Fig.1 Values distribution of original data set

图2 差异表达基因热图和火山图Fig.2 Heatmap and volcano map of the DEGs

图3 GO富集分析和KEGG通路分析Fig.3 GO enrichment analysis and KEGG pathway analysis

2.4 显著富集基因PPI分析

为进一步筛选差异表达基因所编码的蛋白质之间的相互作用关系，采用STRING工具对差异表达基因蛋白相互作用关系进行梳理，得到蛋白质相互作用关系图(见图4)。按照节点数关系筛选得到前10个关键基因，包括：EPS15、STAT4、CCL2、SUN2、SEC24C、SEC31A、GOLGB1、F2R,RAB12和PTK2B。

图4 显著富集差异表达基因蛋白相互作用关系Fig.4 Protein interaction of significantly enriched DEGs

3 讨 论

IgAN目前被认为是世界上最常见的原发性肾小球肾炎之一[1]。MN是肾病综合征常见的病理类型之一，大部分为特发性膜性肾病(Idiopathic membranous nephropathy,IMN)[3]。MN的主要病理机制为：循环的自体抗体与肾小球内的内源性抗原结合，并在肾小球毛细血管壁中形成免疫复合物的沉积，补体激活对肾小球足细胞(Podocytes)的影响和对细胞屏障的破坏，导致NS表现[4]。

探寻IgAN 和MN的疾病发生发展机制以及寻找特异性生物标记物，以便诊断和鉴别甚至发现新的治疗靶点。生物信息学相关技术通过利用生物学、计算机学和信息技术揭示生物数据所蕴含的奥秘[5]。为了寻找可能有助于更好地理解IgAN和MN分子基础并有助于诊断的活性病变的新标记物，使用外周血单核细胞(PBMCs)进行DNA分析。通过下载IgAN和MN患者外周血单核细胞DNA高通量数据集，通过筛选差异表达基因、基因富集分析及蛋白质相互作用关系分析。

分析发现，在具有明显表达差异的250个基因中，包括226个上调的差异表达基因和24个下调的差异表达基因。其中75个显著DEGs，包括73个上调基因，2个下调基因。GO富集分析的生物学过程(BP)主要包括蛋白质转运、内溶酶体到溶酶体转运、趋化因子介导的信号通路作用等。细胞学组分(CC)主要为COPⅡ囊泡、NMDA选择性谷氨酸受体复合物和高尔基体等。分子生物学功能(MF)主要有NMDA谷氨酸受体激活、信号传感器激活和钙粘蛋白结合参与细胞与细胞的黏附等。显著富集差异表达基因KEGG通路分析包括Endocytosis和Hepatitis B的相关信号通路。PPI筛选出EPS15、STAT4、CCL2、SUN2、SEC24C、SEC31A、GOLGB1、F2R,RAB12和PTK2B等关键基因。

EPS15为表皮生长因子受体底物基因，参与细胞生长调节[6]。可能参与细胞增殖的控制，有丝分裂信号的调节，特别是EGFR在网格蛋白涂层凹坑(CCPs)的组装中发挥作用，可能参与IgA介导的免疫反应[7]。STAT4是一种转录因子，它在T细胞和单核细胞中转导IL-12和IL-23的生成，导致单核细胞激活[8]，一些证据显示，STAT4可能在多种自身免疫性疾病的进展中发挥着关键的作用[9]。相关研究利用炎症相mRNA表达谱显示，IgAN患者体内外体趋化因子(C-C motif)配体2 (CCL2)表达上调[10]，表明CCL2可能参与IgA肾脏病的发病和进展。细胞学组分(CC)分析发现主要存在COPⅡ囊泡和高尔基体的差异，研究显示在prechylomicron运输囊泡(PCTV)与高尔基体对接时，存在COPII蛋白，并且是需要SEC24C参与[11]。F2R基因存在功能多态性，研究显示其启动子多态性改变在结节病中的作用，主要导致炎症的加重[12],IgAN和MN存在炎性改变，F2R对其是否存在具体影响，目前尚无确切研究证据。RAB12在人PMBCs磷酸化中起重要作用，在帕金森疾病表现显著[13]，而同SUN2、SEC31,GOLGB1和PTK2B在人IgAN和MN中的具体作用和机制有待进一步研究。

4 结论与展望

筛选出核心差异表达基因,特别是EPS15、STAT4、CCL2,SEC24C和F2R，为IgAN和MN的诊断和鉴别提供简便、可靠的依据补充，甚至提供治疗的新靶点。研究和掌握IgAN和MN疾病特异性的发病机制和特异性标记物，对现阶段IgAN和MN的诊断和鉴别具有重要意义。探讨基因表达及调控，挖掘特异性蛋白质表达和PPI，有助于寻找新治疗靶点。