金丝猴毛首线虫线粒体cox1 基因序列分析

李向勇，李春辉，粟玉刚，范 铁，隆雪明

（1.长沙生态动物园，湖南长沙 410118；2.长沙市农业综合行政执法局，湖南长沙 410013；3.湖南省兽药饲料监察所，湖南长沙 410006）

毛首线虫（或毛尾线虫）也称为鞭虫（whipworm），属于毛尾目（Trichurata）、毛尾科（Trichuridae）、毛尾属（Trichuris），成虫寄生于人与动物的盲肠[1-2]。毛首线虫病（trichuriasis）是人与动物常见的寄生虫病，呈世界性分布，多分布于热带地区（包括中国），是一种容易被忽视的热带寄生虫病[3]。据报道[4-5]，全球毛首线虫感染人数为（6.04～7.95）亿。金丝猴（Rhinopithecus roxellana）是我国特有的动物，被我国政府和《濒危野生动植物种国际贸易公约》（CITES）列为一级保护物种[6]，被列入国际自然保护联盟（IUCN）濒危物种红色名录中的濒危物种。现如今，金丝猴种群繁衍除了面临栖息地被侵犯外，还有来自病毒和毛首线虫的感染困扰[7]。因此，正确鉴定毛首线虫种类，不仅具有重要学术价值，而且对预防和控制毛首线虫病也具有重要的社会和经济意义。

毛首线虫的种内鉴定一直是国际性难题。毛首线虫具有特殊的外形，虽然很容易鉴定到属，但是种内鉴定只能靠虫体大小、交合刺长度、交合刺鞘以及虫卵等形态学特征进行鉴定[8]。当遇到形态相似性较高的虫体和虫卵时，传统的形态学鉴定具有很大的局限性。如今，选用合适的基因分子标记，是寄生虫分子分类学的首要任务。线粒体DNA（mtDNA）具有进化速度快、基因突变率高、母性遗传等特点，是研究寄生虫系统发生学、群体遗传学和分子分类的理想分子标记[9-11]。而线粒体细胞色素c 氧化酶Ⅰ亚基（cox1）基因作为编码基因，进化速度快，以母系遗传为主，且不受基因重组、易位等激变影响，被国际DNA 条形码联盟推荐为首选基因[12]。本研究以采自长沙生态动物园金丝猴体内的毛首线虫作为研究对象，通过PCR 扩增其部分cox1基因（pcox1）序列并进行分析，从而明确金丝猴毛首线虫线粒体cox1基因部分序列能否成为理想的种间遗传标记，旨在为今后金丝猴毛首线虫的分类、鉴别及本病的防治等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 虫体样品

本试验研究的6 条金丝猴毛首线虫样品于2017 年采自长沙生态动物园（金丝猴2016 年从上海野生动物园引进），样品代码标记为B-1、B-2、B-3、B-4、B-5、B-6。

1.2 主要试剂

蛋白酶K，购自Merck 公司；WizardTMDNA Clean-up System 试剂盒，购 自Promega 公 司；EmeraldAmp Max HS PCR Master Mix、DL 2 000 DNA Marker，均购自TaKaRa 公司。

1.3 样品DNA 制备

先利用解剖显微镜观察虫体样品的形态学结构，并用高清照相机拍下虫体图片进行初步形态学鉴定。样品保存于装有70%酒精的玻璃瓶中，置于-20 ℃冰箱保存备用。

从70%的酒精保存液中取出单个虫体，用双蒸水反复吹打冲洗3 次后，置于新的1.5 mL Eppendorf 管中；用灭菌的微型剪刀将虫体组织剪碎，并反复研磨，然后根据WizardTMDNA Cleanup System 试剂盒说明书添加消化体系与20 μL 蛋白酶K；混匀后，放于55 ℃恒温水浴箱中消化15～18 h；将消化好的混悬液再根据说明书提取虫体DNA，DNA 样品分装后置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.4 PCR 扩增pcox1 基因

根据Bowles等[13]报道的引物JB3 和JB4.5（JB3：5'-TTTTTTGGGCATCCTGAGGTTTAT-3'，24 bp；JB4.5：5'-TAAAGAAAGAACATAATGAAAATG-3'，24 bp）来扩增线粒体pcox1，随后将引物交予生工生物工程（上海）股份有限公司合成。扩增体系为25μL：上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，双蒸水10.5 μL，EmeraldAmp Max HS PCR Master Mix 12.5 μL。PCR 过程：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共36 个循环；最后72 ℃延伸5 min。取5 μL PCR 产物进行1%TAE 琼脂糖凝胶电泳，用Good View Nucleic Acid Stain 染色，紫外投射仪下观察结果，凝胶成像系统摄像。

1.5 pcox1 基因序列测定及系统发育树构建

将PCR 产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果用DNAstar 5.0 软件分析，从GenBank 检索现有毛尾科毛首线虫属毛首线虫的cox1基因序列（表1），然后与之进行相似性比对并构建毛首线虫系统发育树，以旋毛虫（Trichinella spiralis，KU321696.1）作为外群，利用ClustalX 1.81 及Mega 5.0 软件对获得的序列和GenBank 的毛首线虫pcox1部分序列进行比对及遗传距离计算，同时利用Mega5.0 程序中的邻位相连法（Neighbor-Joining，NJ）反复运算1 000 次，选取最佳模型，绘制种系发育树。

表1 代表性的毛首线虫cox1 序列信息

2 结果与分析

2.1 形态学检查

显微镜下观察到雄虫交合刺（图1）和虫卵（图2），经反复对照文献和寄生虫图谱结合虫体照片（图3～4），初步确定为金丝猴毛首线虫（Trichuris rhinopiptheroxella）。

图1 雄虫交合刺

图2 虫卵

2.2 PCR 扩增

经PCR 扩增，6 个样品均成功扩增出长度为411 bp 的基因片段，与预期pcox1基因目的片段长度相符，且无非特异性条带，空白对照为阴性（图5）。

图3 雌虫局部

图4 虫体

图5 毛首线虫线粒体pcox1 基因PCR 扩增结果

2.3 测序及分析

扩增所获得的pcox1序列减除引物后长度一致，均为411 bp。将所测得的6 个样本个体的pcox1序列进行种内比较，结果发现这些样本的pcox1序列完全一致，无种内变异。序列中A、G、T、C 含量分别为26.52%、18.73%、36.74%、18.00%。其中A+T 含量（63.26%）明显高于C+G含量（36.74%）。pcox1基因序列种间分析结果显示，种间差异较大，差异率为24.0%～34.1%。

2.4 cox1 基因序列系统发生树

采用NJ 法构建系统发生树（图6）。由图6 可知，6 个样本与GenBank 检索到的Trichuris rhinopiptheroxella处于同一分支，同源性为100%，所在分支与其他毛首线虫所在分支距离较远。

3 讨论

图6 基于cox1 基因序列以NJ 法所构建的金丝猴毛首线虫系统进化树

寄生虫的准确分类鉴定对寄生虫病防治具有重要意义。但单靠传统的形态学方法已经不能准确高效地进行寄生虫分类鉴定。形态学分类方法存在一定局限性，尤其对于相似种或者近缘种，很难从形态上进行区分，而分子生物学的发展很好地解决了这一问题。线粒体cox1作为线粒体编码基因，具有母系遗传、进化速度快、受基因突变影响小等特点，被很多专家学者认为是种内遗传学、分子分类学、分子进化学等学科理想的遗传标记[14-17]。

本研究以长沙生态动物园金丝猴体内采集的毛首线虫为样本进行序列比对。发现分离的6 条金丝猴毛首线虫种内相似性很高（100%），同时与GenBank 上检索的Trichuris rhinopiptheroxella相似性也为100%，而与其他毛首线虫种间差异较大，为24.0%～34.1%。系统发育分析结果显示，毛首线虫分离株与GenBank 上检索的Trichuris rhinopiptheroxella处于同一分支，而与其他毛首线虫分枝相隔较远。依此判定，此次在长沙生态动物园金丝猴体内采集的毛首线虫均为Trichuris rhinopiptheroxella。此次研究结果充分说明毛首线虫的cox1基因序列种内保守而种间差异大，可以作为毛首线虫分类学理想的遗传标记，还为进一步研究毛首线虫的群体遗传结构奠定了基础。