单重PCR 鉴别犬4 种布鲁氏菌检测方法的建立

徐怀英，黄迪海，仉 伟，郝文娟，盛晓丹，秦卓明，2

（1.山东省农业科学院家禽研究所，山东济南 250100；2.山东省健牧生物药业有限公司，山东济南 250100；3.济南市动物生物药品工程技术研究中心，山东济南 250100；4.济南市动物园服务中心，山东济南 250031）

布鲁氏菌病（brucellosis）是一种人兽共患病，由布鲁氏菌属细菌侵入宿主机体引起，其临床发病特点为被感染人和动物长期发热、多汗、关节痛以及肝脾肿大等，且可引起生殖系统疾病，公共卫生意义巨大。

布鲁氏菌属的4 个种均可以感染犬，包括：羊种布鲁氏菌（B.melitensis）、牛种布鲁氏菌（B.abortus）、猪种布鲁氏菌（B.suis）和犬种布鲁氏菌（B.canis）[1]。犬种布鲁氏菌生长菌落为天然粗糙型，而牛种、羊种、猪种布鲁氏菌生长菌落一般是光滑型。由犬种布鲁氏菌引起的犬布鲁氏菌病称为最适寄生型，由其他3 种布鲁氏菌引起的犬布鲁氏菌病称为转移型。在牧区，由于犬多为散养，生食病死畜禽现象普遍存在，犬布鲁氏菌感染率较高，抗体阳性率介于8.16%～42.65%[2-3]。2016—2017 年的济南市宠物犬布鲁氏菌病血清学调查结果显示，光滑型布鲁氏菌抗体阳性率为8.76%，粗糙型布鲁氏菌为1.99%[4]，表明在宠物犬中存在不同程度的布鲁氏菌感染，潜在传播风险较大。

聚合酶链式反应（PCR）是一种快速、特异、敏感的分子检测方法。我国已经建立了Bruce-Ladder PCR 检测布鲁氏菌的国家诊断技术标准（GB/T 18646—2018），但该方法需要首先对病原菌进行分离和纯培养，不适宜在基层推广应用。本研究根据粗糙型布鲁氏菌wbkD及wbkF基因序列缺失351 bp 的特点[5]，通过设计1 对引物并优化反应条件建立了PCR 检测方法。该方法可同时鉴别诊断4 种布鲁氏菌（犬种、牛种、羊种和猪种），既适用于病原菌的纯培养物，又适合于感染犬的血液、流产或排泄物样品的检测，且能一次性区分光滑型（牛种、羊种和猪种）和粗糙型（犬种）布鲁氏菌，适合于基层推广和应用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株B.abortus、B.melitensis、B.suis和B.canis灭活菌液，由中国兽医药品监察所丁家波研究员惠赠；大肠杆菌及沙门氏菌，由山东省农业科学院家禽研究所保存。

1.1.2 犬布鲁氏菌阳性血液样品。经布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原检测为阳性的20 份犬布鲁氏菌血液样品。

1.1.3 主要试剂及仪器 10×PCR Buffer、TaqDNA 聚合酶、dNTP，均购自湖南艾科瑞生物工程有限公司；DL 2 000 bp DNA Marker、DL 1 000 bp DNA Marker，均购自宝生物（北京）有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司；琼脂糖，购自Biowest公司；NanoDropTMOne/OneC 超微量紫外分光光度计、PCR 仪，均购自Thermo Fisher 公司；Tanon 1600 凝胶图像分析系统，购自上海天能科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌基因组DNA 的提取 按照细菌基因组DNA 提取试剂盒说明书，提取上述细菌的基因组DNA，-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物设计 下载GenBank 中登录的B.abortus、B.melitensis、B.suis和B.canis基因组序列并进行比对，根据B.canis基因组中wbkD、wbkF基因序列差异，应 用Primer Premier 5.0 软件设计1 对引物（BF：5'-TCTA TTATTACGGACGGCTGGCTGAG-3'；BR：5'-GTGGTGGCCCATGTGGCGCTT-3'）。引物送北京六合华大基因科技股份有限公司合成。其中，牛种、羊种、猪种布鲁氏菌目的片段长度预计均为717 bp；犬种布鲁氏菌缺失351 bp，目的片段长度预计为366 bp。

1.2.3 反应体系建立及条件优化 PCR反应体系为：10×PCR Buffer 0.25 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，待检DNA 模板2 μL，引物BF 和BR（10 mmol/L）各1 μL，TaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，最后用RNA-free 补足反应体系至25 μL。PCR 反应条件为：95 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，分别设置6 个退火温度（52、54、56、58、60 和62 ℃）退火30 s，72 ℃延伸40 s，共进行35 个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物于4 ℃保存备用。

1.2.4 特异性试验 按照优化的PCR 反应体系及反应条件，分别对4种布鲁氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌基因组DNA 进行序列扩增，然后将PCR 反应产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，验证反应的特异性。

1.2.5 敏感性试验 将4种基因组DNA（犬种、羊种、牛种和猪种）样品分别用NanoDrop ™ One/OneC 超微量紫外分光光度计进行含量和纯度测定，然后对各样品10 倍倍比稀释6 个梯度，各取2 μL不同含量的模板，使用引物BF 和BR 进行PCR 扩增，验证该检测方法的灵敏性。

1.2.6 临床应用 选择20 只发生过流产的布鲁氏菌血清学阳性雌犬，每只犬后肢静脉采集抗凝血1份。参照文献[6]中布鲁氏菌抗凝血样DNA 提取方法提取基因组DNA，利用设计的特异性引物进行PCR 检测，检测该方法在临床上的应用效果。

2 结果与分析

2.1 PCR 反应条件优化

在52、54 ℃退火温度下，PCR 反应条带较亮；56、58 ℃退火温度下，PCR 反应条带逐渐变暗；60、62 ℃退火温度下，未观察到PCR 条带（图1）。通过优化试验，确定该引物退火温度为54 ℃。最佳反应条件为：95 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共进行35 个循环；然后72 ℃延伸10 min。

图1 不同退火温度对牛种、羊种、猪种和犬种布鲁氏菌PCR 反应的影响

2.2 特异性试验

利用建立的PCR 反应体系，对牛种、羊种和猪种布鲁氏菌均能扩增出预期的717 bp目的条带，对犬种布鲁氏菌能扩增出366 bp 目的条带，而对大肠杆菌、沙门氏菌，均未扩增出相应条带，表明建立的PCR 方法特异性较好（图2）。

图2 PCR 方法的特异性试验结果

2.3 敏感性试验

经NanoDrop ™ One/OneC 超微量紫外分光光度计测定，犬种、羊种、猪种和牛种布鲁氏菌基因组DNA 浓度分别为50.7、62.0、78.0 及55.0 ng/μL，分别10 倍倍比稀释6 个梯度，然后进行PCR 并将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳（图3）。

图3 4种布鲁氏菌PCR 反应的敏感性试验结果

从图3 可以看出，当犬种布鲁氏菌基因组DNA 浓度为5.07×（10-2～101）ng/μL 时，利用建立的PCR 方法扩增后均有明显特异性条带，扩增片段大小为366 bp；当浓度等于或小于5.07×10-3ng/μL时，均无扩增条带。当羊种布鲁氏菌基因组DNA浓度为6.20×（10-2～101）ng/μL 时，PCR 扩增后均有明显特异性条带，扩增片段大小为717 bp；当浓度等于或小于6.20×10-3ng/μL 时，均无扩增条带。当猪种布鲁氏菌基因组DNA 浓度为7.80×（10-3～101）ng/μL 时，PCR 扩增后均有明显特异性条带，扩增片段大小为717 bp；当浓度等于或小于7.80×10-4ng/μL 时，均无扩增条带。当牛种布鲁氏菌基因组DNA 浓度为5.50×（10-2～101）ng/μL 时，PCR 扩增后均有明显特异性条带，扩增片段大小为717 bp；当浓度等于或小于5.50×10-3ng/μL 时，均无扩增条带。

由此可见，该方法能检测到犬种、羊种、猪种和牛种布鲁氏菌基因组DNA 最低浓度分别为5.07×10-2、6.20×10-2、7.80×10-3和5.50×10-2ng/μL，表明本方法的检测灵敏度较高。

2.4 宠物犬布鲁氏菌临床检测

对20 份宠物犬布鲁氏菌血清学检测为阳性的血液样品进行PCR 检测，发现5、11 和15 号样品在366 bp 处扩增出特异性条带（图4），表明上述3 份样品犬种布鲁氏菌病原阳性。将这3 份抗凝血样品送中国兽药监察所进行细菌分离鉴定，共分离到2 株犬种布鲁氏菌。

图4 临床血液样品布鲁氏菌PCR 检测结果

3 讨论

感染犬的4 种布鲁氏菌均可感染人，其中以羊种布鲁氏菌毒力和传播性最强，牛种和猪种其次，犬种最弱[7]。伴随着人民生活水平的提高，城镇家庭饲养宠物犬数量庞大，截至2018 年12 月，我国宠物犬数量已高达7 400 万只，已有多例人通过密切接触犬而感染布鲁氏菌的报道[8-10]。因此，高度关注犬布鲁氏菌感染，对于保障人类和宠物健康意义重大。

细菌的分离培养和血清学诊断是布鲁氏菌病检测的主要手段，从血液、流产胎儿、阴道分泌物等材料中分离到布鲁氏菌是最具诊断性的“金标准”。但由于该病菌对人具有感染性，因此，必须在有资质的P3 实验室进行病原分离。同时该菌分离受采样时机等因素影响较大，分离率较低，不利于布鲁氏菌病的早期诊断。血清学诊断便捷简单，但虎红平板凝集试验（RBT）和试管凝集试验（SAT）易出现假阳性，常用于布鲁氏菌病流行病学调查时的初筛，而ELISA 抗体检测易出现假阴性[11]。本研究建立的单重PCR 可一次性鉴别粗糙型（犬种）与光滑型（羊种、牛种和猪种）布鲁氏菌，且在检测时可以直接采取病料组织，十分便捷，方便在基层推广应用。

利用本试验建立的单重PCR 方法对20 份布鲁氏菌血清学阳性犬血清进行检测，共检出3 份犬种布鲁氏菌阳性样品。将该批血液样品送中国兽医药品监察所布鲁氏菌检测实验室进行GB/T 18646—2018 引物的PCR 检测，结果一致。推测可能是由于犬种布鲁氏菌为粗糙型，而其种他为光滑型，不同生物型布鲁氏菌与机体作用机制不同。

布鲁氏菌不同种菌株间基因组同源性非常高[12-13]，如布鲁氏菌16S rDNA 核苷酸序列相似性达99.6%～100%。已建立的聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-RELP）需在单菌落纯化后进行[14]，其他多重PCR 方法需要至少添加4 对以上的引物进行扩增[15]。本研究利用犬种布鲁氏菌在wbkD与wbkF基因序列缺失351 bp 的特点，通过犬种与其他3 种布鲁氏菌扩增长度的差异，确定是犬种还是其他布鲁氏菌种。该方法为犬布鲁氏菌病流行病学调查提供了便捷、特异性好、敏感性高的诊断技术，适于宠物门诊及基层研究单位对犬布鲁氏菌病尽早鉴别诊断，以尽快采取治疗或扑杀措施。