木薯SCARECROW-LIKE（SCL）基因克隆、生物信息学及非生物胁迫下表达分析

樊铸硼　罗兴录　单忠英　黄堂伟　程隆祥　吴美艳

摘要：【目的】克隆木薯SCARECROW-LIKE（MeSCL）基因，对其进行生物信息学分析，并检测其在非生物胁迫下的表达情况，为深入研究木薯MeSCL基因响应非生物胁迫的调控机制提供理论参考。【方法】以木薯品种D346为材料，采用RT-PCR克隆MeSCL基因编码区（CDS）序列，并利用生物信息学分析软件进行序列特征分析，采用实时荧光定量PCR检测其在干旱、盐、氧化和低温胁迫下木薯叶片中的表达情况。【结果】克隆获得的MeSCL基因编码区（CDS）序列全长1655 bp，与参考序列（GenBank登录号LOC110627921）仅存在2个碱基的差异，开放阅读框（ORF）的长度为1560 bp，编码519个氨基酸，编码蛋白分子量为57.84 kD，等電点（pI）为6.08，脂肪系数为80.46%，总平均亲水性指数为-0.195，为亲水性蛋白，含有1个信号肽、6个从内部到外部的跨膜螺旋区和5个从外部到内部的跨膜螺旋区，定位于细胞核和内质网中，属于GRAS蛋白家族成员，具有该家族的保守结构域。MeSCL蛋白三级结构模型显示，该蛋白含有14个典型的α螺旋、10个β-折叠和36个β-转角。MeSCL蛋白与橡树HbSCL蛋白的相似性最高，为90.80%，与蓖麻RcSCR、胡杨PeSCL、毛果杨PtSCR、可可树TcSCR和哥伦比亚锦葵HuSCL蛋白的相似性在80.00%左右。MeSCL基因受干旱、盐、氧化和低温胁迫诱导表达量整体呈升高趋势，但在不同处理时间的表达量存在明显差异，其中，干旱和氧化胁迫下，MeSCL基因均在处理24 h时表达量最高，分别是对照的6.05和11.17倍，而盐和低温胁迫下，MeSCL基因均在处理6 h时表达量最高，分别是对照的11.76和3.80倍。【结论】MeSCL基因参与木薯植株的非生物胁迫响应，正向调控其抗非生物胁迫能力。

关键词： 木薯;SCARECROW-LIKE（SCL）基因;基因克隆;生物信息学分析;非生物胁迫;表达分析

中图分类号： S533.035.3                        文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）08-1888-08

Cloning， bioinformatics analysis and expression under abiotic stress of SCARECROW-LIKE（SCL） gene in cassava

FAN Zhu-peng1， LUO Xing-lu1，2*， SHAN Zhong-ying1， HUANG Tang-wei1，

CHENG Long-xiang1， WU Mei-yan1

（1College of Agriculture， Guangxi University， Nanning  530004， China; 2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources， Nanning  530004， China）

Abstract：【Objective】In this study，the SCARECROW-LIKE（MeSCL） gene of cassava was cloned，then its bioinformatics analysis was carried out and  its expression under abiotic stress was detected to provide theoretical reference for further study on the regulatory mechanism of MeSCL gene in response to abiotic stress. 【Method】Taking cassava variety D346 as material，the coding region（CDS） sequence of MeSCL gene was cloned by RT-PCR，and its structural characteristics were analyzed by bioinformatics analysis software，then observed the expression of MeSCL under drought，salt，oxidation and low temperature stresses by real-time fluorescence quantitative PCR（qPCR）. 【Result】The full-length CDS sequence of MeSCL gene in cassava was 1655 bp. According to alignment with existing target gene sequences on NCBI（GenBank accession No.：LOC110627921），there were two different bases. The length of open reading frame（ORF） was 1560 bp and encoded 519 amino acids，the encoded protein molecular weight was 57.84 kD and the isoelectric point（pI） was 6.08. The fat coefficient of MeSCL protein was 80.46%，total average hydrophilic index was -0.195， which belonged to hydrophilic protein. The MeSCL protein had a signal peptide with six possible internal to external transmembrane helix regions and five possible external to internal transmembrane helix regions. The subcellular localization predicted that the protein was in the nucleus and endoplasmic reticulum and was a member of the GRAS family with the conserved structural domain of the GRAS family. The three-dimensional structure model of MeSCL protein showed that the protein had 14 typical alpha helices，10 beta folds and 36 beta turns. MeSCL amino acid sequence shared the highest similarity of 90.80% with Hevea brasiliensis（HbSCL） protein sequence，about 80.00% similarity with Ricinus communis（RcSCR），Populus euthoides（PeSCL），P. euthoides（PtSCR），Theobroma cacao（TcSCR） and Colombian mallow（HuSCL）. The qPCR data showed that MeSCL gene expression level were increased under drought，salt，oxidation and low temperature stress.However，there were obvious differences in the expression levels at different treatment times. The expression levels of MeSCL genes were the highest at 24 h under drought stress and oxidative stress，which were 6.05 times and 11.17 times as that of the control group. While the expression levels of MeSCL genes were the highest at 6 h under salt stress and cold stress，which were as 11.76 times and 3.80 times as that of the control group respectively. 【Conclusion】The MeSCL gene participates in the abiotic stress response of cassava plants and positively regulates its resistance to abiotic stress.

Key words： cassava; SCARECROW-LIKE（SCL） gene; gene cloning;bioinformatics analysis; abiotic stress; expression analysis

Foundation item： Guangxi Science and Technology Planning Project（Guike AB18221127）; Open Project of State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources（SKLCUSA-b201609，SKLCUSA-b201704）; Independent Research Project of State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources（SKLCUSA-a201802）

0 引言

【研究意義】木薯（Manihot esculereta Crantz）又称树番薯、树木薯，是大戟科木薯属植物，在全球热带地区广泛栽培，我国以广西、广东、海南等省（区）种植较多（杨文钰和屠乃美，2003）。木薯种植地域广，其生长发育面临多种非生物胁迫。SCARECROW-LIKE（SCL）转录因子是GRAS蛋白家族成员之一（Pysh et al.，1999），早期研究发现其在根和芽的径向图案化中发挥重要作用（Gao et al.，2004），后续研究发现其还在植物的生长发育、形态建成和抗逆性中发挥重要作用（郭华军，2009;Cui et al.，2014;Li et al.，2018）。因此，深入研究SCL基因的逆境胁迫响应机制对木薯品种抗逆性改良具有重要意义。【前人研究进展】GRAS由最初的3个家族成员GIBBERELLIN-INSENSITIVE（GAI）、REPRESSOR of ga1-3（RGA）和SCARECROW（SCR）的特征字母命名。GRAS家族蛋白是植物所特有，广泛存在于拟南芥、木薯、番茄、矮牵牛、百合、水稻和大麦等高等植物中，含有5个高度保守的结构域，即LRI、VHIID、LRII、PFYRE和SAW（Bolle，2004）。大量研究表明，GRAS家族蛋白是参与细胞过程的重要调节成分，可调节植物分生组织生长，影响赤霉素（GA）信号转导，响应生物和非生物胁迫，促进根瘤和菌根形成（张文霞等，2016）。早期在拟南芥突变体的研究中发现，SCR控制着根和芽的放射性图案，且在调节胚胎和胚根径向组织中发挥重要作用（Di Laurenzio et al.，1996）。后续研究发现，SCL也为GRAS蛋白家族成员，同样参与植物信息传递和信号转导。如SCL3可能是GA信号传导中的正调节因子，在GA途径中的空间整合纵向根轴上发挥不同的作用;在延伸组织和分化组织中，SCL3作为GAI和RGA的衰减剂，控制根细胞伸长的协调，而在分生组织区中，SCL3-DELLA相互作用维持GA信号传导，并结合SCR/SHR途径，调节成熟基本组织形成分裂的时间和程度（Heo et al.，2011）。研究还发现SCL3作为拟南芥幼苗中DELLA蛋白的直接靶基因，其表达由DELLA蛋白诱导并被GA所抑制，是GA信号传导的正调节因子;且SCL3和DELLA在控制下游GA响应基因和上游GA生物合成基因时相互拮抗，从而实现GA稳态并控制GA介导的植物生长和发育（Zhang et al.，2011）。从松树和板栗中克隆出PrSCL1和Cs-SCL1基因，在植株不定根形成早期阶段可受外源激素诱导在有生根能力的插条中表达（Sanchez et al.，2007）。此外，SCLs基因在光信号传导和物资运输方面也发挥重要作用，SCL21和PHYTOCHROME A SIGNAL TRANSDUCTION1（PAT1）参与光敏色素A（phyA）信号传导，并在phyA信号通路中起正向调控作用（Torres-Galea et al.，2013）;SCL23和SCR是控制维管束鞘细胞命运的决定因素，其中，SCR主要参与糖运输，而SCL23主要参与矿物运输（Cui et al.，2014）。【本研究切入点】目前有关SCLs基因的研究主要集中于模式植物拟南芥根的生长发育及GA代谢途径，但鲜见有关木薯SCLs基因的相关研究报道。【拟解决的关键问题】以木薯品种D346为材料，采用RT-PCR克隆MeSCL基因编码区（CDS）序列，利用生物信息学分析软件进行序列特征分析，采用实时荧光定量PCR检测其在干旱、盐、氧化和低温胁迫下木薯叶片中的表达情况，为深入研究木薯MeSCL基因响应非生物胁迫的调控机制提供理论参考，以期发掘木薯抗非生物胁迫的关键基因，为后续木薯品种抗逆性改良提供基因资源。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试木薯品种为D346，由广西大学农学院木薯课题组提供。高保真酶PrimerSTAR Max DNA Polymerase、PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司;HiScript Ⅱ qRT SuperMix反转录试剂盒、ChamQ SYBR qPCR Master Mix购自诺维赞生物科技（南京）有限公司;超快新型植物RNA提取试剂盒购自华越洋生物科技（北京）有限公司。主要仪器设备：GXZ型智能光照培养箱（宁波东南仪器有限公司）、凝胶成像系统（Bio-Rad，美国）、NanoDrop ND2000超微量紫外分光光度计（Thermo Scientific，美国）、CFX96 Real-Time PCR System荧光定量PCR仪（Bio-Rad，美国）、JY600C电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）、TGL-16M高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）。

1. 2 样品处理及采集

2018年3月24日将木薯D346种植于广西大学科研教学基地，于木薯块根成熟期采集木薯叶片，液氮速冻后于-80 ℃保存，用于基因克隆。逆境胁迫处理：采用盆栽土培法，正常浇水，3个月后选取长势一致的木薯苗，分别进行干旱[20%聚乙二醇6000（PEG-6000）]、氧化（10% H2O2）、低温（4 ℃）和盐（300 mmol/L NaCl）胁迫处理，前三者分别在处理0（对照）、2、6和24 h取木薯苗正4叶，后者在处理0（对照）、2、6和72 h取木薯苗正4叶，叶片经液氮速冻后采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测不同胁迫处理下MeSCL基因的表达情况。

1. 3 总RNA提取及cDNA第一链合成

取少量木薯叶片置于研钵中，加入液氮后迅速研磨成粉末，利用RNA提取试剂盒提取总RNA，并用1%琼脂糖凝胶电泳检测其质量，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定其浓度。参照Prime ScriptTMⅡFirst Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒说明反转录合成cDNA第一链。

1. 4 基因克隆

从本课题组前期试验获得的木薯干旱胁迫转录组数据中筛选出1个差异表达基因，使用Primer Premier 5.0设计其编码区（CDS）特异引物（MeSCL-F和MeSCL-R）（表1）。以cDNA第一链为模板进行PCR扩增。反应体系50.0 μL：2×PrimerSTAR Max Premix 25.0 μL，10 μmol/L正、反向引物（ORF-F和ORF-R）各2.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O补足至50.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s，进行30个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，目的片段用DNA纯化回收试剂盒进行回收，连接至pMD18-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性克隆送至广州艾基生物技术有限公司测序。

1. 5 生物信息學分析

利用NCBI在线工具ORFfinder查找MeSCL基因的开放阅读框（ORF），将其翻译成氨基酸序列，并对氨基酸序列进行BLASTp同源比对。利用ExPASy在线工具ProtParam和ProtScale分析MeSCL蛋白的理化性质;使用TMPRED预测该蛋白的跨膜区;利用PSORT预测该蛋白的亚细胞定位;利用NCBI的CD-search（Conserved domains search database）预测该蛋白的保守结构域。利用SWISS-MODEL和RasMol预测分析MeSCL蛋白的三级结构;用MEGA-X中的邻接法（Neighbor-joining method）构建系统发育进化树。

1. 6 实时荧光定量PCR检测

分别提取不同胁迫处理下木薯正4叶的总RNA，反转录合成cDNA第一链。利用Primer Premier 5.0设计MeSCL基因的定量引物（QMeSCL-F和QMeSCL-R）（表1）。以cDNA为模板、MeActin为内参基因，实时荧光定量PCR检测MeSCL基因在胁迫处理下的表达情况。反应体系10.0 mL：cDNA模板1.0 mL，10 mmol/L正、反向引物各0.2 mL，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5.0 mL，ddH2O 3.6 mL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环。

1. 7 统计分析

用Excel 2016整理数据，采用2-ΔΔCt法计算MeSCL基因的相对表达量（Livak and Schmittgen，2001）。

2 结果与分析

2. 1 MeSCL基因克隆

如图1所示，以木薯叶片cDNA为模板PCR扩增获得1条长约1600 bp的片段。使用DNAMAN 6.0将该序列与已知参考序列SCARECROW-LIKE（GenBank登录号LOC110627921）进行比对，结果显示该片段长度为1655 bp，与参考序列仅有2个碱基的差异（图2），表明该片段为MeSCL基因的CDS序列。

2. 2 生物信息学分析结果

MeSCL基因ORF的长度为1560 bp，编码519个氨基酸，编码蛋白分子量为57.84 kD。MeSCL蛋白质等电点（pI）为6.08，脂肪系数为80.46%，总平均亲水性指数为-0.195，属亲水性蛋白，含有1个信号肽、6个从内部到外部的跨膜螺旋区和5个从外部到内部的跨膜螺旋区，定位于细胞核和内质网中。MeSCL蛋白的保守结构域预测结果表明，该蛋白属于GRAS家族成员，具有该家族的保守结构域（图3）。利用SWISS-MODEL对MeSCL蛋白进行同源建模，以获得其三级结构模型（图4），利用RasMol对该模型进行分析，结果显示该蛋白具有14个典型的α螺旋、10个β-折叠和36个β转角。利用NCBI在线工具BLASTp将MeSCL蛋白的氨基酸序列进行同源比对，结果发现其与橡树（Hevea brasiliensis）HbSCL蛋白（XP_021662072.1）的相似性最高，为90.80%，与蓖麻（Ricinus communis）RcSCR（XP_002529844.1）、胡杨（Populus euphratica）PeSCL（XP_011004025.1）、毛果杨（P. trichocarpa）PtSCR（XP_002302035.3）、可可树（Theobroma cacao）TcSCR（XP_007050241.2）和哥伦比亚锦葵（Herrania umbratica）HuSCL（XP_021281121.1）蛋白的相似性均在80.00%左右（图5）。可见，SCL基因在物种进化和分化过程中未发生明显变异。

2. 3 MeSCL蛋白的系统进化分析结果

从上述BLASTp同源比对结果中，选择与MeSCL蛋白氨基酸序列同源性高的蛋白进行系统发育进化树构建，结果（图6）显示，MeSCL蛋白与橡树HbSCL（XP_021662072.1）、蓖麻RcSCR（XP_002529 844.1）和麻风树JcSCR（XP_012085853.1）蛋白同处一个分支，其中，与橡树HbSCL蛋白亲缘关系最近，与可可树TcSCR（XP_007050241.2）和哥伦比亚锦葵HuSCL（XP_021281121.1）蛋白亲缘关系较远。可见，不同植物SCL蛋白的氨基酸序列具有高度保守性。

2. 4 MeSCL基因的表达分析结果

实时荧光定量PCR检测结果（图7）显示，与对照相比，MeSCL基因受干旱、盐、氧化和低温胁迫诱导时表达量整体呈升高趋势，但在不同处理时间的表达量存在明显差异，其中，干旱和氧化胁迫下，MeSCL基因均在處理24 h时表达量最高，分别是对照的6.05和11.17倍，而盐和低温胁迫下，MeSCL基因均在处理6 h时表达量最高，分别是对照的11.76和3.80倍，处理24和72 h后表达量下调。可见，MeSCL基因能快速响应干旱、盐、低温和氧化等逆境胁迫，尤其在盐和低温胁迫下最明显，推测植株受到的损伤也较严重，导致后期表达量明显下降;虽然MeSCL基因在不同胁迫处理下表达模式存在明显差异，但均表明MeSCL基因参与木薯植株的非生物胁迫响应，正向调控其抗非生物胁迫能力。

3 讨论

虽然GRAS蛋白在植物生长发育过程中发挥重要作用，但目前对木薯GRAS蛋白缺乏深入研究。通过对植物进行胁迫处理，在不同生长时期进行采样，克隆抗胁迫相关基因，并进行功能研究，可扩展植物抗逆基因库，为综合改良植物抗逆性提供思路和参考（王雪，2017）。本研究从木薯D346中克隆MeSCL基因CDS序列，长度为1655 bp，编码519个氨基酸，与参考序列（GenBank登录号LOC110627921）存在2个碱基差异，但编码的氨基酸序列无差异，推测是由木薯品种间差异所导致。将MeSCL蛋白与其他物种SCL蛋白进行氨基酸序列同源比对和系统进化分析，结果显示，MeSCL蛋白与橡树HbSCL蛋白的相似性最高，为90.80%，说明二者亲缘关系较近，且与胡杨PeSCL、蓖麻RcSCR和哥伦比亚锦葵HuSCL蛋白相似性也较高，均在80.00%左右，表明SCL基因在物种进化和分化过程中未发生明显变异。经MeSCL蛋白的结构域分析发现，该蛋白具有GRAS家族的保守结构域，证明本研究克隆所得到的MeSCL基因属于GRAS基因家族成员。

植物在生长发育过程中常受到生物和非生物胁迫的影响，如病原侵染、干旱、高渗透和低温等均对植物生长发育带来极大的负面影响。植物为了适应多变的生长环境，在长期的进化历程中，植物形成多种抗胁迫机制，并积累了丰富的抗逆基因，通过抗逆基因的表达调控来响应上述各种逆境胁迫，以提高植株的抗胁迫能力（Seki et al.，2002;周芳，2013）。本研究采用实时荧光定量PCR检测MeSCL基因在不同胁迫处理下的表达情况，结果显示，MeSCL基因受干旱、盐、氧化和低温胁迫诱导，在木薯叶片中的表达量整体呈升高趋势，表明MeSCL基因参与木薯的非生物胁迫响应。目前已有许多前人研究证明，GRAS基因家族成员参与植物非生物胁迫响应。如郭华军（2009）通过拟南芥AtSCL15突变体表型研究证明AtSCL15基因积极响应干旱胁迫;Ma等（2010）研究显示，将胡杨PeSCL7基因转入拟南芥中过表达，可增强转基因植株的抗旱性和耐盐性;郭鹏等（2013）研究发现，转入玉米ZmSCL基因的烟草在抗盐试验中萌发率在90%以上，而野生型的萌发率不足50%，表明ZmSCL基因响应盐胁迫，可提高转基因植株的抗盐性;周莲洁等（2013）研究结果显示，盐穗木HcSCL13基因在盐胁迫下表达量显著上调;Li等（2018）研究发现，芜菁BrLAS作为GRAS家族转录因子基因，可正向调控植株的干旱耐受性。综上所述，SCL蛋白在植物响应逆境胁迫中发挥重要作用，能帮助植物提高不良环境因子抵抗力。在今后研究中，可构建植物过表达载体或iRNA干扰载体使Me-SCL基因在植物中过表达或沉默，从而进一步研究和验证MeSCL基因在植物生长发育及抗逆境胁迫过程中的功能。

4 结论

MeSCL基因参与木薯植株的非生物胁迫响应，正向调控其抗非生物胁迫能力。

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（責任编辑 陈 燕）

收稿日期：2019-10-27

基金项目：广西科技计划项目（桂科AB18221127）;亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室开放课题（SKLCUSA-b201609，SKLCUSA-b201704）;亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室自主研究课题（SKLCuSA-a201802）

作者简介：*为通讯作者，罗兴录（1957-），博士，教授，主要从事木薯育种与栽培生理研究工作，E-mail：luoxinglu@sina.com。樊铸硼（1995-），研究方向为作物栽培与理论技术，E-mail：1018775429@qq.com