增香复合微生物对造纸法再造烟叶香味成分的影响

左满兴 薛磊 崔洪亮

摘要 [目的]研究微生物发酵技术对造纸法再造烟叶品质的影响。[方法]使用一种增香复合微生物发酵处理再造烟叶原料，通过GC-MS分析了其主要香味成分，并比较了不同处理对再造烟叶纤维特性及产品各类香气成分的影响。[结果]增香复合微生物发酵处理可使烟草原料纤维分丝帚化效果更好，显著提升制浆及感官品质;致香成分中，6大类45种化合物的总量较对照样最高增幅达到20.93%。微生物发酵处理样中，香味物质如茄酮、巨豆三烯酮、糠醇、3-氧代-α-紫罗兰醇、香茅醛、新植二烯和麦芽酚等含量明显增加;微生物发酵处理造纸法再造烟叶样品较对照样在烟气细腻度、香气、甜润感、灼热和干燥感、余味舒适度等方面均有明显改善。[结论]该研究可为利用生物技术改善造纸法再造烟叶品质的研究及应用提供参考。

关键词 再造烟叶;微生物;烟草纤维;香味成分;感官质量

中图分类号 TS44+4  文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2020）19-0194-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.051

Abstract [Objective] To study the effect of microbial fermentation technology on the quality of papermaking process reconstituted tobacco （PMRT for short）.[Method]An aromaenhancing complex microorganism was used for the fermentation of PMRT.The main aroma components were analyzed by GCMS，and the effects of different treatments on the smoke quality of PMRT and tobacco fiber were compared.[Result]The experimental results showed that：Tobacco fiber has better silk separation effect and better pulp quality by aromaenhancing complex microorganism treatment.The total amount of 45 compounds in 6 categories of PMRT fermented by aromaenhancing complex microorganism was 20.93% higher than that of the control.Compared with the control，the contents of aroma components such as solanone，megastigmatrienone，furfuryl alcohol，3oxoαionol，citronellal，neophytadiene and maltol in the microbial fermentation samples were significantly increased.The PMRT treated by microbial fermentation were significantly improved in terms of flue gas fineness，aroma，sweetness，heat and dryness，and aftertaste comfort.[Conclusion]The study can provide reference for the research and application of biotechnology to improve the quality of PMRT.

Key words Reconstituted tobacco;Microorganism;Tobacco fiber;Aroma components;Sensory quality

基金項目 陕西中烟工业有限责任公司重点科技项目（ZB15006）。

作者简介 左满兴（1974—），男，安徽贵池人，工程师，从事卷烟配方研究。

收稿日期 2020-03-30

造纸法再造烟叶（Papermaking process reconstituted tobacco，简称PMRT）是以废弃的烟梗、烟叶碎片、烟末等为原料，利用造纸法工艺制成的烟草再生利用产品[1]。造纸法再造烟叶具有填充值高、可塑性强、燃烧性能好、焦油释放量低等特性[2-3]。造纸法再造烟叶作为卷烟配方尤其是低焦油卷烟配方中的重要组分，可有效改善卷烟填充结构和燃烧性能，降低卷烟焦油和烟碱等有害物释放量[4-6]，是卷烟降焦减害的有效技术措施之一。然而，由于造纸法再造烟叶原料多为烟梗、低次烟叶或烟末等烟草废弃物资源，造纸法再造烟叶存在着香气较少、刺激较明显、口感不理想等缺陷，影响了其在卷烟产品中的应用效果和添加量。因此，如何提升造纸法再造烟叶品质、解决其感官质量缺陷是烟草领域的重要研究方向。

目前，许多学者通过改变造纸法再造烟叶的生产工艺来提升再造烟叶品质[7-9]，同时利用生物技术来改进造纸法再造烟叶品质缺陷的研究也逐渐成为热点[10]。近年来，部分研究利用酶技术[11-13]或微生物发酵处理[14-16]，通过将再造烟叶原料如烟梗中的大分子物质进行转化分解[17-18]，或对原料浸提液进行发酵处理后再涂布于再造烟叶基片，以期改善造纸法再造烟叶内在品质。此类研究多是通过生物技术手段从造纸法再造烟叶制造环节改善再造烟叶品质。然而，对于如何通过微生物发酵技术直接提高造纸法再造烟叶成品品质的研究较为缺乏。

笔者探讨微生物发酵技术对造纸法再造烟叶成品内在质量的影响，并对再造烟叶成品中主要致香成分进行分析，结合感官评价验证微生物发酵技术在提高造纸法再造烟叶品质的应用效果，以期为利用生物技术改善造纸法再造烟叶品质的研究及应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器、试剂与材料 试验仪器：6890-5973 GC-MS气质联用仪（美国Agilent公司）;RM-200型转盘式吸烟机（德国Borgwaldt KC公司）;HP-5MS色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 mm，美国Agilent公司）;剑桥滤片（英国Cerulean公司）;OLYMPUS-BX51光学显微镜（日本奥林巴斯公司）。试验试剂：LB 固体培养基（商品化试剂）、正十七烷、异丙醇、二氯甲烷等试剂均为国产分析纯。

供试造纸法再造烟叶由云南瑞升烟草技术集团有限公司生产。

供试增香复合微生物：包含枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）Y1、X7、X8（菌种专利保藏号分别为CGMCC No.13602、CGMCC No.13603和CGMCC No.13604），增香复合微生物专利配方为Y1∶X7∶X8=（0.001～1）∶（0.001～1）∶（0.001～1）。

1.2 方法

1.2.1 烟草提取液的制备。准确称取 1.00 kg 烟末、烟梗及碎烟片（按1∶1∶1混合），加入7.00 kg热水，于 70 ℃下提取45 min，过滤，获得烟草提取液。

1.2.2 浸提液发酵。

1.2.2.1 休息细胞的制备。采用 LB 培养基将微生物培养到 OD600值为 1.0 左右停止（此时细胞浓度约为 135个细胞/mL），离心去掉培养基，收集细胞置于 pH 为 7.0的PBS 缓冲液中，作为休息细胞备用[19]。

1.2.2.2 造纸法再造烟叶微生物发酵。将增香复合微生物休息细胞按造纸法再造烟叶原料投料量0.1%（T1处理）和0.2%（T2处理）的添加量制成菌悬液，将菌悬液均匀喷洒在供试造纸法再造烟叶原料表面，以等量灭活休息细胞处理作对照（CK），置于特定温湿度条件下发酵48 h，随后将原料按照再造烟叶生产工艺（图1）制成再造烟叶产品。待再造烟叶丝平衡至水分为（12.0±0.5）%，取少量烟草纤维，采用光学显微镜观察其形态特征。

1.2.3 造纸法再造烟叶样品的制备。将上述处理后的造纸法再造烟叶丝卷制成烟支，置于温度为（22±1）℃、相对湿度为（60±2）%的恒温恒湿箱中平衡水分48 h后，挑选重量、吸阻符合要求的烟支样品用于感官质量评吸和香味成分分析。

1.2.4 香味成分分析样品的制备。根據GB/T 19609―2004[20]的要求，对样品主流烟气中的粒相物进行捕集，将烟支在标准抽吸条件下通过吸烟机抽吸，用剑桥滤片捕集主流烟气，将滤片收集放入三角瓶中，加入40 mL二氯甲烷和10 μL内标溶液（内标液为5 mg/mL异丙醇），静置15 min后再振荡40 min，过滤，将滤液浓缩至1 mL后进行GC-MS分析。

1.2.5 香味物质GC-MS分析条件。

1.2.5.1 色谱条件。进样口温度：250  ℃;进样量：1.0 μL;载气：He;分流比：40∶1;柱流速：0.8 mL/min;程序升温：初始温度50  ℃保持2 min，以5  ℃/min升温至160  ℃，然后再以8 ℃/min升到260  ℃，保持15 min。传输线温度：280 ℃。

1.2.5.2 质谱条件。EI电子能量：70 eV;扫描范围：35～550 amu;离子源温度：230  ℃;溶剂延迟：2 min;质谱库：NIST谱库和WILEY标准数据库。

对每个峰进行串联检索，并将各鉴定物质峰面积与内标物峰面积的比值作为定量对比分析依据，定量结果以μg/支表示，分析烟气中香味成分。

1.2.6 感官评吸。由陕西中烟工业有限责任公司技术中心具有卷烟感官评吸技术资格的7人组成感官评吸评委组，采用暗评的形式，参照烟草行业YC/T 498—2014再造烟叶（造纸法）感官评价方法[21]的要求，对样品烟支进行感官质量打分和综合评价。

1.3 数据处理  利用Microsoft Excel和DPS软件进行数据处理及统计分析。

2 结果与分析

2.1 微生物处理对再造烟叶纤维的影响 采用光学显微镜分析了微生物处理对再造烟叶打浆过程中烟草纤维表面形貌的影响，结果见图 2。从图2可以看出，空白样 （图2-CK） 的表面较为平整，受制浆磨损影响较小，轮廓边界较规整，有明显形状外形;而经过微生物处理后打浆 （图2-T1、T2） ，烟草纤维的表面粗糙破损情况严重，有分丝起毛现象，并产生少量细小的纤维碎片，轮廓边界已经变得很不规则，无明显形状外形。这主要是由于微生物能够分解烟草原料中的木质素、纤维素，促进制浆时吸水润胀[22-23]，使烟草原料受盘磨的切断和挤压作用更显著，从而产生大量的细小碎片，增加烟草纤维的比表面积，为再造烟叶产品定型后涂布过程的料液吸收带来优势，从而增加再造烟叶产品香味成分含量。微生物处理不仅可提高制浆效果，同时，也可加快制浆过程，为再造烟叶生产企业节能减排提供一定帮助。

2.2 香味物质总量的变化 样品主流烟气中的香味物质由GC-MS分析，得到的各组分质谱图经质谱库检索，对照和2组处理样中鉴定出相同的香味化合物共计45种。与对照相比，经增香复合微生物发酵处理的造纸法再造烟叶2组样品的香味物质总量均有提升，T1和T2处理样的45种香味物质总量分别为363.11和417.91 μg/支，较对照样分别提升5.08% 和20.93%。同时，45种化合物中，类胡萝卜素类降解生成的香气物如新植二烯、巨豆三烯酮和3-氧代-α-紫罗兰醇，西柏烷类降解生成的香气物如茄酮[24-25]，氨基酸降解生成的香气物如吲哚和3-甲基-1H-吲哚[26]，美拉德反应生成的香气物如糠醇、糠醛和5-（羟甲基）-2-呋喃甲醛等香味物质[27-28]的含量在增香复合微生物发酵处理样中均比对照样有不同程度的提高。

为便于分类比较，将45种化合物按其官能团不同可分为6大类：其中，酮类化合物13种，醇类化合物7种，醛类化合物4种，萜烯类化合物6种，酯类化合物4种，苯及稠环芳烃类化合物11种。微生物发酵处理的造纸法再造烟叶中的各类化合物含量较对照样有不同程度的提高（图3）。

2.3 酮类化合物含量的变化 如表1所示，增香复合微生物发酵处理的造纸法再造烟叶中，13种酮类化合物的含量较对照样有不同程度的提高，其中T2处理样较对照样中酮类化合物总量提高了34.48%。多数酮类化合物是由烟叶中类胡萝卜素降解所产生的，该类物质是形成烤烟细腻、高雅和清香的主要成分，酮类化合物香味阈值相对较低，是对烟叶香气质量构成贡献率较大的一类物质。与对照相比，巨豆三烯酮、茄酮、2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮、3，5-二羟基-2-甲基-4H-吡喃-4-酮的含量在微生物发酵的造纸法再造烟叶T2处理样中分别提升了28.42%、35.56%、36.43和49.69%。同时研究表明，这4种酮类香味物质对于提高烟气天然烟香、甜香、改变粗劣气息有明显效果。

2.4 醇类化合物含量的变化 如表2所示，样品中共同检测到的醇类化合物有7种。研究表明，醇类化合物具有清新的花香、果香，其中糠醇、3-氧代-α-紫罗兰醇、植醇和豆甾醇具有增强烟草自然烟香和清甜感的作用，能给卷烟带来清甜的香韵，使烟气有细腻感。與对照相比，在经增香复合微生物发酵的造纸法再造烟叶T1处理样中，上述4种醇类香味物质合计含量增加了13.67%，T2处理样中增加了19.61%，尤其是糠醇和3-氧代-α-紫罗兰醇，在T2处理样中分别较对照增加了124.56%和38.42%。

2.5 醛类化合物含量的变化（表3） 醛类化合物在卷烟调香中起到丰富烟香和甜润感的作用。其中，糠醛、香茅醛、5-（羟甲基）-2-呋喃甲醛、5-甲基-2-呋喃甲醛是分别具有调制烘烤香、坚果香、果香、酒香风味的香气物质。与对照相比，经增香复合微生物发酵的造纸法再造烟叶T2处理样中，这4种醛类香气物质合计增幅为43.57%，其中香茅醛增幅最高，为47.36%。

2.6 萜烯类化合物含量的变化 如表4所示，样品中共同检测到的萜烯类化合物有6种。与对照相比，增香复合微生物发酵的造纸法再造烟叶T2处理样中的此类化合物总量增加了12.48%。萜烯类化合物是烟草中重要成分，能改进和提高烟香的自然风味。而其中的新植二烯、D-柠檬烯、3-壬烯、胆甾烷-3，5-二烯是形成烤烟细腻、高雅和清香的主要成分，其香气阈值较低。与对照相比，上述4种萜烯类香味物质合计在T1处理样中增加了2.65%，在T2处理样中增加了13.51%，尤其是D-柠檬烯和新植二烯，在T2处理样中分别较对照增加了59.09%和11.62%。

2.7 酯类化合物含量的变化 烟草中酯类化合物对烟草的香气和吃味有一定的影响，可以增加烟气的醇和感。如表5所示，增香复合微生物发酵的造纸法再造烟叶T1处理样中4种酯类化合物合计较对照样变化不大，但T2处理样较对照样提高了9.85%。

2.8 苯及稠环芳烃类化合物含量的变化 如表6所示，样品中共同检测到的苯及稠环芳烃类化合物有11种。与对照相比，增香复合微生物发酵的造纸法再造烟叶T1和T2处理样中的此类化合物含量分别增加了7.46%和18.49%。苯及稠环芳烃类物质能增加烟气的丰满度，如吲哚、3-甲基-1H-吲哚、麦芽酚、4-乙基-苯酚、2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、2，3′-二吡啶可调配豆香、辛香、焦甜香，提高香气浓郁度等。与对照相比，这6种苯及稠环芳烃类香味物质合计在T1处理样中增加了23.01%，在T2处理样中增加了42.48%，尤其是麦芽酚含量在T1和T2处理样中分别较对照增加了127.75%和118.19%。

2.9 感官质量变化 通过评吸比较造纸法再造烟叶样品感官品质差异，结果见表7。由表7可知，增香复合微生物发酵处理样品的整体感官质量均好于未接种对照样，对供试造纸法再造烟叶烟气的香气、杂气和干燥感有所改善，对烟味指标改善不明显。其中，处理样T2的感官质量得分较对照样由72.9分提高到77.6分，主要表现为烟气细腻度较好，香气有明显提升，甜润感增加，烟气的杂气、灼热和干燥刺激感降低，余味残留明显减轻。说明经增香复合微生物发酵可提升供试造纸法再造烟叶的感官质量。

3 结论

（1）微生物处理烟草原料后，制浆过程中烟草纤维的表面粗糙破损情况严重，有分丝起毛现象，并产生少量细小的纤维碎片，纤维轮廓边界已经变得很不规则，无明显形状外形，使烟草原料纤维分丝帚化效果更好，显著提升制浆品质。

（2）施加微生物发酵处理的样品中6大类45种化合物总量较对照样最高增幅为20.93%。再造烟叶中占比较大的醛类、醇类、酮类和苯及稠环芳烃类化合物中，类胡萝卜素降解物、西柏烷类降解物、氨基酸降解物和美拉德反应物等烟草重要香味物质，如茄酮、巨豆三烯酮、糠醇、3-氧代-α-紫罗兰醇、香茅醛、新植二烯、麦芽酚等含量均有明显增加。

（3）感官评吸结果表明，微生物发酵处理造纸法再造烟叶样品较对照样在烟气细腻度、香气、甜润感、杂气、灼热和干燥感、余味舒适度等方面均有明显改善。

总之，施加增香复合微生物发酵处理可提高造纸法再造烟叶中香味成分含量，提升造纸法再造烟叶整体感官品质。

参考文献

[1] 况志敏，刘建平，王茜茜.造纸法再造烟叶发展综述[J].纸和造纸，2018，37（6）：26-31.

[2] 陈祖刚，蔡冰，王建新，等.国内外造纸法薄片工艺与品质比较[J].烟草科技，2002（2）：4-10.

[3] 孙霞，苏文强.造纸法烟草薄片的研究现状及应用展望[J].华东纸业，2010，41（4）：34-39.

[4] 汪华文.造纸法薄片在卷烟中的应用效果分析[J].烟草科技，2000（8）：15-16.

[5] 钟德义，钟科军，李和平.复合造纸法再造烟叶的制备及效果分析[J].烟草科技，2009（7）：12-14.

[6] 尚善斋，雷萍，吴恒，等.造纸法烟草薄片的研究进展[J].纸和造纸，2015，34（4）：45-49.

[7] 韩卿，张美云，吴养育，等.造纸法烟草薄片制造工艺的研究[J].西北轻工业学院学报，2002，20（1）：19-22，34.

[8] 吴宇航，李思东.造纸法烟草薄片的研究进展[J].广东化工，2012，39（5）：90-92.

[9] 黎冉，张欣，刘雪光.我国造纸法再生烟草薄片生产技术研究进展[J].广东化工，2016，43（22）：110-111.

[10] 毛多斌，何景福，李兴波，等.生物技术在卷烟工业中的应用[J].郑州轻工业学院学报（自然科学版），2005，20（3）：32-34，73.

[11] 郑小嘎，赵昌政，韦绪伦，等.酶法改善造纸法烟草薄片品质初探[J].山东食品发酵，2010（1）：11-13.

[12] 柏婷.造纸法再造烟叶果胶降解技术研究[D].昆明：昆明理工大学，2014.

[13] 龙章德，张鹏，薛云，等.酶解—美拉德反应修饰改善烟草薄片品质的研究[J].食品与机械，2016，32（5）：188-193.

[14] 郭刚.双菌种发酵提高造纸法烟草薄片品质的研究[J].宁夏农林科技，2012，53（11）：104-105.

[15] 王充.热醇化和产香酵母发酵对烟草薄片浓缩液品质的影响及应用研究[D].郑州：郑州轻工业学院，2018.

[16] 叶建斌，王璐，杨峰，等.类芽孢杆菌发酵原料浸提液提升再造烟叶品质[J].中国烟草学报，2019，25（1）：33-38.

[17] 杨虹琦，周冀衡，罗泽民，等.微生物和酶在烟叶发酵中的应用[J].湖南农业科学，2004（1）：63-66.

[18] 李国栋，马海燕，于建军，等.纤维素酶降解烟叶中纤维素的作用效果[J].中国农学通报，2008，24（12）：256-259.

[19] 叶建斌，王璐，杨峰，等.类芽孢杆菌发酵原料浸提液提升再造烟叶品质[J].中国烟草学报，2019，25（1）：33-38.

[20] 全国烟草标准化技术委员会.卷烟 用常规分析用吸烟机测定总粒相物和焦油：GB/T 19609—2004[S].北京：中国标准出版社，2005.

[21] 国家烟草专卖局.再造烟叶（造纸法）感官评价方法：YC/T 498―2014[S].北京：中国标准出版社，2014.

[22] 汪兵，刘苇，刘璐，等.玉米芯残渣的底物特性对其酶水解效率的影响[J].中国造纸学报，2018，33（4）：17-22.

[23] 陈丽卿.生物质精炼技术与制浆造纸的结合[J] .中国造纸学报，2019，34（3）：77-81.

[24] 谢剑平.烟草香原料[M].北京：化学工业出版社，2009.

[25] 史宏志，刘国顺，杨惠娟，等.烟草香味学[M].北京：中国农业出版社，1998.

[26] 赵昶灵，杨焕文，邓建华，等.云南烟区烤烟‘KRK26中部叶片质体色素在烘烤中降解产物的种类、含量及其相关性[J].中国农学通报，2011，27（25）：60-67.

[27] AJANDOUZ E H，PUIGSERVER A.Nonenzymatic browning reaction of essential amino acids：Effect of pH on caramelization and Maillard reaction kinetics[J].Journal of agricultural and food chemistry，1999，47（5）：1786-1793.

[28] 邵惠芳，楊永锋，刘国顺，等.烤烟发育过程中香气成分的变化动态研究[J].河南农业大学学报，2007，41（4）：368-373.