核体paraspeckle结构及形成研究进展

刘晨

摘要 细胞核内存在复杂的亚核结构，它们在结构和空间分布上有所区别，以参与特定的生物学进程。paraspeckle是建立在长非编码RNA（lncRNA）NEAT1上的不规则核体，NEAT1和paraspeckle蛋白在空间上排列形成核壳状。paraspeckle及其成分通过将特定的蛋白质和/或转录本保留在其核内，在许多细胞过程中控制基因表达，进而影响细胞进程，包括分化和一些应激反应。通过对近年来关于paraspeckle研究成果的归纳总结，综述了paraspeckle的结构及形成过程等方面的研究进展，为进一步探究paraspeckle调控生理学过程的机制提供一定的理论基础。

关键词 核体;paraspeckle;结构;形成

中图分类号 Q26  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2020）19-0004-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.19.002

Abstract There are complex subnuclear structures within the nucleus that differ in structure and spatial distribution to participate in specific biological processes. Paraspeckle is an irregular nucleosome built on NEAT1， a long noncoding RNA. NEAT1 and paraspeckle proteins are arranged in space to form nucleosomes. Paraspeckle and its components control gene expression in many cellular processes， including differentiation and some stress responses， by retaining specific proteins and/or transcripts in nucleus. By summarizing the research results of paraspeckle in recent years， this paper reviewed the research progress in the structure and formation process of paraspeckle， providing a theoretical basis for further exploring the mechanism of paraspeckle regulating physiological processes.

Key words Nuclear bodies;Paraspeckle;Structure;Formation

细胞核是一个大而复杂的细胞器，它是高度结构化的、具有复杂的内部结构，但其特征尚未完全阐明。细胞核的一个特征是：存在不同的亚核体，这些核体包含了一些特定的离散的蛋白质和核酸，它们参与了特定的细胞核进程[1]。大多数亚核小体存在于染色质之间的区域，包括Cajal小体、PML小体和nuclear speckles，直径0.2～2.0 μm，包含多个核调节因子，如DNA结合蛋白质和/或RNA结合蛋白质，参与基因表达的不同阶段，包括转录、RNA加工、输出和存储这些因子等过程[2-3]。

paraspeckle是由Visa、Puvion- dutilleul、Bachellerie和Puvion（1993）首次发现的非膜质核体，电子显微镜检测到，它们是处于染色质颗粒相关带的电子致密结构。2002年，一项研究用質谱法对纯化的人核仁进行蛋白质组学分析，共鉴定出271种蛋白，其中约30%为新蛋白[4]。后续分析发现了其中一种新蛋白并不富集于核仁，而是弥散分布在核浆内，并集中于一些亚核斑点[5]。因为它们被发现定位于染色质间接近但不同于nuclear speckles，因此这些斑点被命名为paraspeckle。定位于这些结构的新蛋白随后被命名为paraspeckle protein 1（PSPC1）。2009年，4个研究组各自独立地发现了NEAT1 lncRNA（或称为MENε/β），最初叫nuclear enriched abundant transcript 1，随后改称为nuclear paraspeckle assembly transcript 1，是paraspeckle一个重要的结构性组分[6-9]。

paraspeckle最初被描述为富含DBHS（drosophila behavior human splicing）家族RNA结合蛋白的核体[1]。DBHS蛋白家族的成员已经被证明可以结合双链和单链DNA和RNA，并与许多不同的复合物发生交联[10]。DBHS家族蛋白参与RNA产生和加工的许多方面，包括转录起始、转录终止和剪接[11-16]。在分子水平上，paraspeckle被认为可以将蛋白质或转录本隔离到核内，充当调节核质中活性分子水平的分子海绵[17-18]，从而调节多种细胞进程及生理过程。

paraspeckle是由其结构性RNA NEAT1和多个RNA结合蛋白组成的大型核糖核蛋白复合物。NEAT1和paraspeckle蛋白在空间上排列以形成有序结构[19]。大多数核物质表现出液滴状特征，与周围的核质相分离，并能融合形成较大的液滴[20-21]。液滴通过液-液相分离（LLPS）进行组装，这是通过形成多个分子间多价相互作用来完成的[22-24]。核体包含多个具有内在无序区域的RNA结合蛋白，这些区域使RNA结合和诱导LLPS，因此是非膜性核体形成的驱动力[20-21]。从paraspeckle蛋白的相互作用网络图中发现，RBM14（RNA结合蛋白14）是一种重要的paraspeckle组件，它通过其朊样结构域（PLD）介导了一种关键的相互作用，将其他几种重要蛋白连接到网络中，对paraspeckle的形成至关重要[25]。笔者通过查阅核体paraspeckle结构及形成方面的文献，对paraspeckle的结构、组分及装备等方面进行了综述，为进一步研究paraspeckle生物发生过程及其生物学功能提供了一定的理论依据。

1 paraspeckle的结构特征及功能

paraspeckle是一种体积小、大小不规则、分布不均匀的亚核体。在哺乳动物组织和细胞中，paraspeckle广泛分布，大多数鼠源和人源细胞系和组织被证明含有paraspeckle，包括转化和原代细胞系，胚胎成纤维细胞和致瘤活组织[5，7-9，26]。根据细胞类型的不同，paraspeckle的数量在每个核5～20个斑点（例如，HeLa包括13～17个斑点/核，NIH3T3细胞包括5～10个斑点/核）[7]。paraspeckle被发现存在于染色质间区域，夹在nuclear speckles和染色质间。电镜研究和荧光图像显示，paraspeckle大小范围为0.5～1.0 μm直径，并呈现不规则的肠样形状[27]。

DBHS RNA结合蛋白家族成员在paraspeckle中特别丰富，包括含非POU域八聚体结合蛋白（NONO）、脯氨酸和谷氨酸富集剪接因子（SFPQ）和PSPC1，在paraspeckle中特别丰富[28-29]。paraspeckle是依赖于RNAPⅡ转录的RNase敏感结构，这表明它们的维持需要RNAs[30]。Neat1是一种哺乳动物特异性的lncRNA，是paraspeckle的结构组成部分。Neat1的缺失会导致该核体的解体[6-9]。Neat1的2种亚型由一个共同的启动子诱导形成的，长（小鼠为20 kb）的Neat1_2亚型是paraspeckle形成所需，而短（小鼠为3.2 kb）的Neat1_1亚型对其结构功能的维持是非必需的[31-32]。Neat1_2在paraspeckle里的排列是有序的，5′和3′的末端位于边缘，Neat1_2的中部位于paraspeckle中央区[33]。观察结果表明，Neat1_2呈放射状排列在香肠状paraspeckle的横平面上，为paraspeckle蛋白的组装提供了一个结构支架。使用结构光照明显微镜对这些核物质进行精细的结构分析，发现呈现良好的核壳类球状结构，蛋白和RNA转录本沿径向取向的Neat1_2转录本有序分布[34]。对paraspeckle结构维持至关重要的蛋白定位于核心或斑块，而不是paraspeckle的外壳[31]，说明前一种成分起着结构上的作用，而外壳成分与核质成分结合，发挥其功能。

paraspeckle已知的主要功能与其RNA成分有关。 Paraspeckle被认为可以调节多种细胞过程，包括高A-to-I编辑水平的mRNAs的核保留[6，26]，通过SFPQ的隔离来控制转录[17]，以及对特定细胞中聚肌苷-聚胞苷酸双链核苷酸的免疫反应[18]。此外，paraspeckle是由病毒感染、蛋白酶体抑制和分化引起的应激反应性结构[9，17-18]。从生理学上讲，NEAT1是参与小鼠雌性生殖的特定组织的发育和各种癌症进程所必需的[35-38]。特别是，据报道，一部分Neat1基因敲除的雌性小鼠卵巢黄体的形成受损，这种Neat1显著表达的结构参与了妊娠期孕酮的生成。在怀孕期间缺乏黄体的形成会导致不育和/或雌性可育怀孕更少[37]。一些含有PLD的paraspeckle蛋白（FUS、TDP-43等）[31，39]已知会导致肌萎缩性脊髓侧索硬化症（ALS）的突变[40-44]。在ALS运动神经元中也可见到paraspeckle，在额颞叶变性相关情况下NEAT1表达上调[39，45]。

2 paraspeckle的组成成分

2.1 NEAT1/Men ε/β RNA

现在已经知道，特别是对哺乳动物来说，基因组的大部分是转录的，以产生蛋白质编码和非蛋白编码RNA[46]。近年来，对非编码RNA的定义及功能的研究大量呈现。在2007年的一项针对核非编码RNA种类定义的研究中，描述了2种丰富广泛表达的核富集常染色体非编码转录本，称为NEAT1（也称为Men ε/β）和NEAT2（也称为MALAT-1）[47]。RNA-FISH显示MALAT-1定位于核斑点，而NEAT1则在临近核斑点的亚核斑点（显示为paraspeckle）处被发现，NEAT1和MALAT-1 非编码RNAs由RNA Pol Ⅱ产生，独立于蛋白编码基因。NEAT1有2个亚型：NEAT1_1和NEAT1_2（之前称为Men ε和Men β），它们共享5′端3～4 kb的序列，即NEAT1_1，更长的亚型NEAT1_2含有额外的约20 kb的RNA[48]。NEAT1_2 RNA的3′末端经剪切产生一个特别的tRNA样分子[9，49]。NEAT1_1在其3′端具有典型的聚腺苷酸信号（PAS）。而NEAT1_2的tRNA样结构会被RNase P识别、剪切，暴露出一个基因组编码的oligo（a）序列和一个独特的3′端三重螺旋结构（3′TH）。剪切得到的tRNA样小分子不稳定，迅速降解[50]。3′TH是体内外稳定NEAT1_2的关键[49，51-52]，但3′TH质粒对paraspeckle的组装不是必需的[31]。

利用CRISPR-Cas9介导的敲除试验对人的NEAT1_2进行研究，可以将其划分为3个功能不同的结构域，分别负责NEAT1的稳定、亚型选择和paraspeckle裝配，都是形成paraspeckle所必需的。位于5′（0～1 kb）和3′末端（3′TH）的结构域是NEAT1稳定所必需的，值得注意的是，5′端1 kb区域被确定为NEAT1稳定和paraspeckle形成所需的其他功能区域[52]。NEAT1_1的多聚腺苷酸化位点（PAS）上游（2.1～2.8 kb）和下游（4.0～5.1 kb）2个区域促进了NEAT1_2的表达，抑制了NEAT1_1的表达。当PAS完好时，该结构域发挥作用，这表明该结构域抑制了PAS依赖的聚腺苷酸的合成，从而促进了NEAT1_2的合成。此外还有报道，NEAT1_1聚腺苷酸的调节是通过一种独特的机制发生的，即CPSF6/Nudt21与靠近PAS的CUGA序列簇结合，从而促进NEAT1_1的聚腺苷酸化。HNRNPK通过与位于CUGA簇和PAS之间的嘧啶延伸结合，干扰聚腺苷酸化。PAS附近域的作用与依赖于HNRNPK的机制之间的关系尚不清楚，NEAT1的亚型转换可能至少受2种不同的机制控制，每种机制都依赖于特定的细胞类型[19]。BLAST算法分析比较NEAT1_2序列显示，在3种哺乳动物中出现了一些不同长度和相似性的重复序列，一些重复序列与已知的LINE和SINE元件有重叠，即NEAT1_2的一个相对较大的中间区域（8.0～16.6 kb），缺失分析显示其对paraspeckle组装来说是必需的，该结构域与5′及3′末端结构域组成的NEAT1_2突变体（mini-NEAT1）能够形成一个结构有序的paraspeckle[52]。进一步的缺失分析表明，中间结构域至少包含3个功能子域（9.8～12.0、120～130、15.4～16.6 kb）。中间结构域和外部区域以及中间结构域本身之间似乎存在复杂的多重功能冗余[52]。一些lncRNAs（如XIST）据报道含有重复序列延伸，这些重复序列具有重要的功能作用[53-54]，这可能提示了NEAT1_2含有重复遗传元件的中间区域为何对paraspeckle的组装发挥关键作用。

Mao等[51]使用基因组整合报告系统表明，RNAPⅡ从其基因组位点转录NEAT1可以在转录位点诱导paraspeckle的从头形成。另一方面，人工聚集的NEAT1不能诱导paraspeckle形成，表明paraspeckle是在其基因组位点与新生的NEAT1共同转录形成的[55]。NEAT1转录受各种内外部条件、病原体和化学物质的调节[9，17，28，35，38，56]。最近，对NEAT1调控子的基因组大范围筛选发现了paraspeckle和线粒体之间的交叉调控，该交叉调控受ATF2转录调控下游因子对NEAT1的调控[57]。

2.2 paraspeckle蛋白

迄今为止，已知超过40种蛋白在paraspeckle中积累，大部分是富集RNA识别基序（RRMs）、锌指结构域和K同源域的丰富的核RNA结合蛋白[31，58]。根据每种蛋白缺失时引起的paraspeckle破坏的程度，可以将这些蛋白分为3类[31]：第1类蛋白质对paraspeckle的结构维持至关重要，它们被进一步细分为Ia类蛋白和Ib类蛋白，Ia类蛋白是生成或稳定Neat1_2（如SFPQ、NONO和RBM14）所必需的，Ib类蛋白不影响Neat1_2的量（如FUS/TLS和BRG1）[8，25，31];第2类蛋白（如TARDBP）的缺失导致具有paraspeckle的细胞数量大幅减少;第3类蛋白（如PSPC1）对paraspekcle的形成没有明显的影响[31]。所有的paraspeckle蛋白都具有RNA结合能力，但不一定参与共同的生物学过程[34]。

PLD正逐渐成为基因调控的重要模块，一个新兴的概念是PLD允许蛋白质“功能聚集”，形成高阶组装体和显微镜下可见的核糖核蛋白颗粒[59]。将蛋白质和RNA浓缩在一个有限的空间中被认为可以产生更有效的基因调控过程。Hennig等[25]对已知的以及一些推定的paraspeckle蛋白进行了酵母双杂交筛选，得到了一个根据paraspeckle蛋白之间相互作用绘制的网络图，在相互作用网络中，PLD蛋白过度表达：网络中66%的蛋白具有PLD（19/29），而55%的起始蛋白具有PLD（26/47）。其中，RBM14 PLD介导了一种关键的相互作用，将其他几种重要蛋白连接到网络中。酵母双杂交和免疫共沉淀试验证实，RBM14 PLD与NONO的强烈相互作用是必需的，而且这种相互作用不依赖于RNA[25]。此外，在对RNA结合蛋白FUS的研究中发现，其PLD包含许多重复的[G/S]Y[G/S][60-61]，负责将FUS定位于paraspeckle[62]。PLD在体外以水凝胶的形式表达，形成网状网络[63-64]，而FUS重复序列中的中心酪氨酸对水凝胶的形成和胞质中应激颗粒的靶向作用至关重要[63]。RBM14与FUS相似，均对paraspeckle的形成至关重要。

3 paraspeckle的装配形成

paraspeckle是由lncRNA NEAT1及一些蛋白质通过蛋白-RNA相互作用、蛋白-蛋白相互作用构建而成的巨大核糖核蛋白复合物。

NONO和SFPQ与NEAT1_2的功能交互启动了paraspeckle组装[19，52]。NONO和SFPQ在细胞中形成一种主要的异质二聚体，NONO中特有的NOPS结构域负责其与DBHS家族蛋白的二聚[65]。主要缔合的NONO/SFPQ二聚体随后可通过卷曲螺旋（CC）域引发聚合，最终可能覆盖整个NEAT1_2 结构性RNA。PAR-CLIP数据显示，PSP结合位点广泛覆盖整个NEAT1_2区域，3个子域包含多个NONO和SFPQ的突出结合峰[52]。此外，先前的透射电镜研究表明，SFPQ可以通过CC域聚合形成高阶复合物[66]。即NEAT1_2的子域作为NONO/SFPQ二聚体的主要结合位点，使后续聚合成为可能，并形成NEAT1_2核糖核蛋白复合物的基础[20]。

LLPS是由具有低复杂性结构域（LCDs）的蛋白质完成的[20]。LCDs缺乏明确的三维结构，为多价弱粘着分子间相互作用，如静电、pi堆积和疏水相互作用提供了基础[22，24，67]。在一个阈值浓度以上，形成多价相互作用的蛋白质可以自组装并经历LLPS，从而形成大量的无膜体，如Cajal小体[52]。最近有报道表明NEAT1 RNA片段可以促进FUS液滴在非特异性RNAs缓冲液中体外成核[68]。大多数paraspeckle蛋白包含被归类为含有PLD的LCDs，这可以有效地诱导LLPS[25，28，52]。paraspeckle蛋白能快速地进出paraspeckle，因此paraspeckle具有相分离体的特征之一——高度的动态性。结构性RNA NEAT1极有可能为含LCDs的蛋白（如FUS和RBM14）提供多个结合位点以促进其局部浓度，并最终在其自身的转录位点附近诱导LLPS，以形成paraspeckle[20]。

此外，最近的证据表明，分子间RNA-RNA相互作用在核糖核蛋白颗粒的形成中起作用，重复的RNAs会形成独特的核体样斑点[69-71]。且药物导致NONO与paraspeckle解离后，仍可检测到较弱的NEAT1斑点[52]。最近的RNA结构mappings已经确定了NEAT1_2分子内的大量RNA-RNA相互作用，这些相互作用可能发生在转录位点或NEAT1高度集中的paraspeckle内[72]。这些结果都表明独立于蛋白的NEAT1 RNA-RNA相互作用也参与了paraspeckle的形成。

4 展望

目前，包括paraspeckle中的NEAT1_2 lncRNA在內的8个参与构建核体lncRNAs可被分类为结构性RNAs[73-79]，均可以通过局部隔离特定的PLD蛋白来集中和触发LLPS。最近Hirose等[19]根据结构性RNA候选基因的半提取特征开发了一种转录组范围的筛选方法。通过对HeLa细胞进行转录组水平的分析，发现了45个具有半可提取特征的RNAs，其中前10个最丰富的RNAs在核斑点中均表现出明显的定位[20，67]。这些发现表明在人类转录组中存在不明的结构性RNAs，进一步探索位于功能域的结构性RNA元件将为结构性RNA功能机制提供更多的见解。

NEAT1_1亞型对于paraspeckle的形成是必不可少的，其作用至今仍知之甚少。NEAT1_1和NEAT1_2共有的5′端基因结构使得这2种亚型之间的功能关系难以详细分析。最近的研究发现，HeLa细胞中NEAT1_1的实际含量比NEAT1_2低10倍，说明NEAT1_1并不是paraspeckle的主要成分[67]。基因组编辑介导的每个NEAT1亚型缺失进一步发现，NEAT1_1定位于许多被称为“microspeckles”的non-paraspeckle斑点，它们可能具有独立于paraspeckle的功能[80]，有待进一步探索。

调节核糖核蛋白颗粒的形成正在成为癌症和神经退行性疾病的潜在治疗应用。特别相关的是肌萎缩性侧索硬化症，它与很多核内含PLD蛋白的细胞质聚集体有关，在许多情况下是由含PLD蛋白的突变引起的[25，81-82]。现在已知有6种paraspeckle蛋白（FUS、TDP-43、SS18L1、HNRNPA1、TAF15和EWSR1）在发生突变时会导致ALS，其他的paraspeckle蛋白可能是新的ALS基因的候选对象。PLD介导的功能性聚集在ALS RNA结合蛋白中的重要性越来越受到重视，这为进一步研究如何在疾病中干扰这些过程打开了大门。不同PLD中的重复基序，以及这些重复基序中的差异如何与核糖核蛋白复合物和其他装配物的功能聚合相关仍然是一个需要探索的问题。

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