降糖药物相关基因芯片检测技术的建立和应用

卢雪玲 再努尔·买合木提 王宁

(新疆医科大学 1第二附属医院，新疆 乌鲁木齐 830000；2第一附属医院)

糖尿病(DM)是一种以高血糖为特征的内分泌代谢紊乱综合征〔1〕，肥胖、家族遗传、运动缺乏等是引起DM的主要危险因素〔2〕。DM主要分为4种类型，其中90%以上为2型糖尿病(T2DM)〔3〕。虽然普遍认为T2DM基本致病机制是胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷，但其发病机制目前仍不清楚，但研究表明是环境和遗传因素共同作用的结果〔4，5〕。目前T2DM的治疗包括饮食、运动调节和口服降血糖药物。但口服降血糖药由于遗传因素在个体间药效动力学和不良反应等存在差异〔6〕。故从基因水平上研究降糖药物相关基因多态性，对指导个体差异化治疗、避免不良反应和提高药物安全性有重要作用〔7〕。从化学结构分类看降糖药物分为5类〔8〕。磺脲类口服降血糖药物通过与受体结合，引起K+-ATP通道关闭，β细胞膜去极化，钙离子浓度升高，进而使胰岛素分泌增加，相关的基因有 CYP2C19、KCNJ11、ABCC8、TCF7L2 和 IRS(胰岛素受体底物)1等〔9～11〕。双胍类(二甲双胍、苯乙双胍)口服降血糖药物能促进脂肪组织对葡萄糖的摄取，拮抗抗胰岛素因子，相关基因有有机阳离子转运体基因(OCT)1和OCT2，二者分别在肝脏和肾脏中表达〔12〕。胰岛素增敏剂(噻唑烷二酮类)可促进脂肪酸氧化和糖的吸收，增加骨骼肌、肝脏、脂肪组织对胰岛素的敏感性，相关基因有PPARγ和脂连素基因(APM)1〔13〕。促胰岛素分泌药(非磺脲类)降糖药物包括瑞格列奈(诺和龙)和那格列奈，作用机制为通过刺激胰腺释放胰岛素而使血糖水平快速降低，但增加了低血糖的风险，相关基因有有机阴离子转运多肽(OATP1)〔14〕。基因芯片是基于分子生物学中核酸互补杂交原理的一门新技术，具有高通量、大规模、平行性等特点，对于不同个体药物筛选有非常重要作用〔15〕。基于糖尿病患者个体间遗传突变位点多，异质性强及人群患病率及携带致病基因的比例高等特点，建立快捷、高通量的基因诊断方法对差异化治疗和安全用药有重要意义。本研究以P450酶基因和OCTs相关基因为候选基因，通过Fluidigm公司生产的带有12个SNP位点的芯片检测门诊收集的34例糖尿病患者。

1 材料和方法

1.1一般资料 34例患者均来自新疆医科大学第二附属医院内分泌科门诊，均为维吾尔族，男13例，女21例，于2016年1～12月收集，年龄为26～80〔平均(52.7±6.72)〕岁，病程(6.24±3.31)年。在进行体重指数(BMI)、血糖、总胆固醇(TC)和三酰甘油(TG)、血浆胰岛素和C肽等生理指标测定确诊为DM后。经知情同意，对所有患者进行病史调查(包括家族史、DM史及降糖药物使用情况等)，同时进一步明确DM类型。

1.2基因芯片技术建立相关材料 稀释液、晶芯BioMark HD微阵列芯片扫描仪、Juno分析系统、质控探针和 DNA 芯片、杂交盒(SNPtypeTMGenotyping Kit)及杂交试剂均由Fluidigm公司提供。PCR荧光染料和质控探针分别购自QIAGEN和Life Technologies。

1.3样本采集和处理 在征得研究对象知情同意后，用EDTA抗凝采血管抽取外周静脉血5 ml。所有血样用小量基因组DNA抽提试剂盒(英捷领先生物)提取DNA，利用核酸测定仪检测DNA的纯度和浓度，于-20℃保存备用。

1.4引物及探针设计 探针和引物采用Fluidigm SNP Type Assay Design网站设计合成，每个位点都有3个对应的引物：STA、LSP和ASP1/ASP2，见表1。

1.5基因芯片构建及检测 通过文献筛查，我们发现12个位于P450酶基因和OCTs相关基因上的SNP位点，这些位点均已证明与遗传性糖尿病有相关性。以提取的DNA为模板，采用多重等位基因特异性PCR (ARMS-PCR)同时结合芯片技术。选取带有Tag标签序列的基因位点特异性引物扩增SNP位点所在的片段并进行荧光标记。

1.5.1PCR 多重PCR体系：将2组引物分成A和B两个反应体系，各加入DNA 0.5 μg，等位基因特异性引物(ASP1和ASP2)各100 μmol/L，位点特异性引物(LSP)100 μmol/L，补充DNA扩增混合液至终体积为40 μl。PCR反应程序：预变性，96℃ 1 min；扩增，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，32个循环；延伸：70℃ 45 s，60℃ 10 min。该过程终降温速率为0.4℃/s，升温速率为0.2℃/s。

1.5.2杂交与清洗 将标记的DNA加热至95℃变性5 min后，立即冰浴3 min。从不同扩增体系中(同一模板)各取2.5 μl PCR产物加到10 μl杂交缓冲液，将混合液加到芯片的微阵列区域，50℃预热水浴中杂交1 h。杂交结束后，在42℃洗涤液中洗涤2 min，之后在0.2×SSC溶液中室温洗5 min，甩干后扫描。

表1 12个SNP位点的引物和探针

1.5.3结果判定 利用Fluidigm SNP Genotyping Analysis软件(Fluidigm公司，美国)，针对降糖药物相关基因常见的12个突变位点(表2)进行基因分型分析。

表2 12个降糖药物相关基因位点信息

2 结 果

2.1降糖药物相关基因芯片检测结果 基因芯片检测34例糖尿病患者，1例发生rs10509681，rs11572080和rs662301突变，3例发生rs12208357突变，4例发生rs1057910突变，5例发生rs4149056突变，6例发生rs11920090突变，8例发生rs72552763碱基缺失，12例发生rs316019和rs683369突变，发生rs2016520突变的患者最多，达15例。

2.2突变位点的遗传结构分析 12个位点中，有1个是碱基缺失，芯片检测结果表明有1个在所有患者中未检测到突变。对剩余10个位点进行遗传结构分析(表3)，结果显示rs2016520，rs316019和rs683369位点在群体中杂合度较大，表明这些位点在群体内变异程度大。rs2016520和rs316019位点处于中度多态(0.25

2.3突变位点Hardy-Weinberg平衡检验 纳入研究的12个位点，其中rs2016520，rs12208357，rs316019和rs683369 4个位点Hardy-Weinberg平衡检验有统计学意义(P<0.05)。其他位点可能在进化过程中受选择压的影响。见表4。

表3 突变位点的遗传结构分析

表4 位点Hardy-Weinberg平衡检验

3 讨 论

基因学可明确遗传因素对药物效应的影响，从而指导临床合理用药具有重要意义〔16，17〕。细胞色素P450 酶基因对药物的氧化还原和水解起催化作用，能影响药物的代谢速率，是重要的药物代谢酶〔18〕。相关研究表明，血糖异常表达与P450 酶活性密切相关，P450基因敲除的模式动物脂肪组织对葡萄糖的摄取能力增强，胰岛素对肝糖原分解的抑制能力提高〔19〕。研究中发现22例有P450基因位点的突变，表明这些患者产生DM的原因可能是P450 酶活性被诱导，酶总含量升高，进而所产生的大量活性氧(ROS)，最终造成糖代谢紊乱和血糖升高。CYP450 酶系的表达受遗传、年龄、性别和环境等影响，患病状态下CYP450 酶系各亚型会产生诱导和抑制，进而导致药物受到影响，产生严重的毒性反应〔20〕。

许多药物发挥作用需要基因的作用，其疗效可能因为这些基因的突变而改变。由于二甲双胍在体内不与蛋白结合，不被代谢，而OCT家族基因可促进二甲双胍的转运从而使其广泛分布在包括肠、肝脏和肾脏在内的多个身体组织中〔21〕。如OCT1有助于将二甲双胍转运入组织液，在肾小管重吸收中扮演重要角色，OCT2可促进二甲双胍从循环系统到肾小管上皮细胞中的吸收，OCT3可影响二甲双胍在肝脏中的吸收〔22～24〕。OCTs基因突变位点与降糖效果显著相关。其中OCT1基因属于溶质转运家族，负责把二甲双胍转运进入肝细胞进行代谢，是目前OCTs家族基因中研究最多的。如携带OCT1 rs622342 C位点的患者服用二甲双胍后，与AA基因型患者相比糖化血红蛋白(HbA1c)水平的降低较缓慢〔25〕。OCT l基因胞内降解片段中的突变可影响其与许多药物的绑定。研究纳入的OCT1 rs2282143-2位点，在全球很多人群中都被检测到，该突变可导致转运体活性显著降低，但是不会彻底失活〔26〕。随着转录组测序，全基因组关联分析等技术的进步，降糖药物相关基因的发现和克隆也取得了重大进展。但这些基因及不同位点的突变在不同种族甚至相同种族不同人群中都有很强的特异性。基因芯片技术在近几年的基因诊断中运用愈来愈广泛，采用核酸分子杂交，将大量特定的基因片段或寡核苷酸片段作为探针，有序且高密度地排列固定于载体上，产生二维 DNA 探针阵列，从而得到基因突变的信息〔27〕。基因芯片技术可以同时、快速、检测多个突变位点，自动化程度高。本研究成功构建了P450酶基因和OCTs基因相关突变位点的芯片。