丁苯酞对急性脑梗死大鼠血液流变学及血清同型半胱氨酸水平的影响

闫欣 江涛 李娜 唐彦

(河北省保定市第二中心医院，河北保定 072750)

急性脑梗死(ACI)是一种临床常见的脑血管疾病[1]，提高脑梗死的治愈率将是人们面临的主要任务。大量研究表明，在脑缺血和缺氧后24h 内，大量血管内皮生长因子(VEGF)和其他神经营养因子(NF)发生应激增殖，并在缺血性半影区中开始产生大量内皮细胞，并扩展到梗塞区域[2,3]。而血液粘度增加和红细胞聚集是溶栓和患者死亡后第二次血栓形成的主要原因[4]。因此，有效降低血液粘度并减少炎症反应以改善高凝状态具有重要意义，可降低溶栓后再出血风险。

丁苯酞（DL-3-正丁基酞，NBP）是首先在我国上市的一类新药[5]，对急性缺血性中风具有治疗作用[6]。NBP 可抑制神经细胞凋亡，并保护神经细胞免受由缺血和缺氧引起的损伤，神经功能缺损、脑缺血和记忆损害[7]。超敏C 反应蛋白(hs-CRP)是中风等脑部疾病的危险因素之一。为进一步研究NBP 在脑梗死治疗中的价值，着重分析了NBP 对血液流变学、血清同型半胱氨酸水平和hs-CRP 及血管内皮因子这些指标的影响，以及NBP 对神经细胞凋亡的调节作用及其机制，以期为ACI 有效治疗方案提供理论参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 动物模型的建立和处理分组

实验动物为雄性Sprague-Dawley 大鼠（8 周龄，250～300g），购于中国科学院上海医学研究院，将其喂养在笼子里，在昼夜节律的室温下喂食。将大鼠分为(CK,n=10)、ACI 组(ACI,n=10)和药物组(ACI+NBP,n=10)，三组均接受相同的饮食。在实验结束时用戊巴比妥钠(70mg/kg)处死。所有动物程序均按照动物研究指南进行，并由医院委员会审查并批准。

1.2 血浆Hcy 的检测及检测设备

经过1 夜禁食后，空腹收集大鼠血液样本。将样品储存在-80℃用于后续实验。血浆样本通过高压液相色谱法检测Hcy 的浓度，参考Ozdem 等[8]方法。仪器设备：K2025 高效液相色谱仪（济南海能仪器股份有限公司）。

1.3 ELISA 法检测大鼠血清中VEGF 和hs-CRP 的水平

将100μL 样品稀释液和血清添加到每个孔中，然后在37℃的恒温箱中保温1.5h。随后，将100μL 生物素标记的抗体工作溶液添加到每个孔中，在37℃下孵育1h。之后，将100μL 的抗生物素蛋白-HRP 标记的工作溶液添加到每个孔中，在37℃下孵育30min。用磷酸盐缓冲盐水(PBS; Gibco,Grand Island,NY,USA)洗涤3次后，将TMB（3,3'，5,5'-四甲基联苯胺）底物溶液(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)洗涤加入以终止反应，使用酶标仪测量吸光度。最后，根据计算公式计算VEGF 和hs-CRP 的水平。

1.4 TUNEL 法检测大鼠脑组织神经细胞凋亡

将脑组织切片用4%多聚甲醛固定，用PBS 洗涤3 次，并逐滴添加50μL TdT 酶反应溶液。随后滴加50μL 链霉亲和素-TRITC 标记溶液，在黑暗中孵育30min。用PBS 洗涤3 次后，用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色溶液(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO,USA)保留细胞核，然后在室温下孵育15min。最后，在显微镜下观察染色。

1.5 数据处理与统计分析

均采用SPSS 20.0 软件进行统计分析。实验数据表示为平均值±标准差。首先进行方差的均一性，然后进行t检验以比较两组之间的差异。单向方差分析用于比较不同组之间的差异，然后进行事后检验（最低显着性差异）。P＜0.05 被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 NBP 对ACI 大鼠脑神经元凋亡的影响

通过TUNEL 染色法检测了ACI 大鼠脑神经元凋亡，结果表明，与对照相比，ACI 大鼠神经元细胞凋亡数目显著增加（图1），而使用NBP 处理后神经细胞凋亡的情况得到了缓解，基本恢复到CK组水平。

2.2 大鼠中红细胞压积和血沉的变化

对大鼠红细胞压积和血沉进行检测，结果发现，与CK 组相比，ACI 大鼠红细胞压积由37.4%显著增加至42.7%，而使用NBP 后红细胞压积恢复到37.9%，接近CK 组 状态（图2A，P＜0.01）。在血沉检测结果中，ACI 大鼠血沉由15.52mm/h 增加到18.86mm/h（图2B），且在NBP 处理后显著降低至16.18mm/h（P＜0.01）。

图1 NBP 对ACI 大鼠脑神经元凋亡的影响

图2 ACI 大鼠中红细胞压积（A）和血沉（B）的变化情况

2.3 血浆黏度和纤维蛋白原含量水平的变化

对大鼠血浆粘度检测结果如图3A，ACI 大鼠中血浆粘度和假手术组（CK）对照相比有显著的升高，并在NBP 处理后恢复初始水平（P＜0.01）。相似的，ACI 大鼠中纤维蛋白原也由较低水平的2.98mg/L 显著增加至3.66mg/L，而在ACI+NBP 组则显著降至2.68mg/L（图3B，P＜0.01）。这些结果说明，NBP能够显著改善ACI 大鼠血液流变学指标，从而对大鼠起到保护作用。

图3 ACI大鼠中血浆黏度（A）和纤维蛋白原含量水平（B）的变化情况

2.4 血清同型半胱氨酸水平的变化

同型半胱氨酸（Hcy）是评价ACI 的重要指标，利用高效液相色谱仪检测了不同分组大鼠血清Hcy水平，结果如图4 所示。与CK 组相比，ACI 大鼠血清中Hcy 含量显著提高约1.6 倍（P＜0.01），而ACI+NBP 组大鼠中则与对照差异不显著（P＞0.05）。说明NBP 能有效减少ACI 大鼠Hcy 水平，有效保护ACI 大鼠。

图4 ACI 大鼠中血清同型半胱氨酸水平的变化情况

2.5 血管内皮因子和超敏感C 反应蛋白水平的变化

为了进一步验证实验结果可靠性，还对大鼠血管内皮因子(VEGF)和hs-CRP 水平进行了检测。结果：ACI 大鼠VEGF 含量较对照组显著增加约1.2倍（P＜0.01），而ACI+NBP 组大鼠VEGF 则与CK组无显著差异（图5A）。同样，hs-CRP 检测结果与VEGF 结果类似，NBP 的处理显著降低其在ACI大鼠中的高表达（图5B，P＜0.01），从而有效缓解了ACI 的症状。

图5 ACI 大鼠VEGF（A）含量和hs-CRP（B）水平的变化

3 讨论

我国是脑血管疾病高发国家[9]，缺血性脑血管疾病的发病率占脑血管疾病的70%～80%，且脑梗死死亡率和致残率相对较高[10]。因此，疾病严重程度的早期评估、及时的针对性治疗已成为脑梗死研究重点[11]。

He 等[12]指出，DL-NBP 对创伤性脊髓损伤具有神经保护和抗炎作用。体内外实验均证明DLNBP 可以显着增强小胶质细胞的活化和炎性因子的释放，提高脊髓损伤的运动能力，并减少大鼠模型腔内脊髓损伤的面积。Zhao 等[13]发现DL-NBP 对脑外伤具有良好的治疗作用，同时实验证明，用DL-NBP 治疗后损伤周围区域的凋亡因子水平显著降低。实验也发现用NBP 处理后ACI 大鼠中神经元细胞凋亡数目显著减少，说明其对神经元细胞凋亡具有有效地抑制作用，从而保护脑组织细胞免受损伤。研究结果还显示，用NBP 治疗后的ACI 大鼠中红细胞压积、血沉、血浆黏度和纤维蛋白原均显著低于对照组，由此表明NBP 具有促进纤维蛋白溶解的作用及能有效改善ACI 大鼠的血液流变学性质。以对ACI 大鼠起到保护作用。

Hcy 是在蛋氨酸代谢过程中形成的一种含硫非蛋白质氨基酸[14]，是动脉粥样硬化等血管疾病发病的危险因子之一。已证实Hcy 与许多疾病密切相关[15]。总血浆Hcy 升高被称为高同型半胱氨酸血症（HHcy）。研究证明HHcy 可减轻内皮功能障碍，促进毒性半胱氨酸加合物代谢并维持氧化应激[16]。

hs-CRP是脑梗死患者炎症反应重要指标之一，hs-CRP 水平的提高能够有效指示炎症反应的严重程度，是脑梗死患者预后不良的高危因素之一[17,18]报道，hs-CRP 的增加对动脉粥样硬化斑块进展与脱落具有显著促进作用[19]。而血管内皮因子(VEGF)主要作用是调节机体血管渗透性，在机体脑组织缺氧情况下，活化巨噬细胞和单核细胞以及星形胶质细胞，能够分泌VEGF，从而加重患者缺血脑组织水肿[20]。实验经过检测发现，NBP 能够有效的降低大鼠因ACI 引起的VEGF 和hs-CRP 水平急剧增加的情况，抑制了其显著的增加，从而有效的缓解脑梗死大鼠炎症和血管内皮功能。给予ACI 大鼠NBP治疗有助于神经功能修复，抑制神经细胞凋亡的发生，改善ACI 大鼠血液流变学和同型半胱氨酸水平，以及影响血管内皮功能和超敏C 反应蛋白水平，从而改善ACI 大鼠的生存质量。