嘉宝果叶片对高血糖小鼠的降血糖作用

林宝妹，邱珊莲，张树河，张 帅，洪佳敏，张少平，郑开斌

（福建省农业科学院亚热带农业研究所，福建 漳州 363005）

0 引言

【研究意义】嘉宝果（Myrciaria cauliflora），又名珍宝果、树葡萄，是桃金娘科（Myrtaceae）拟爱神木属（Myrciaria）热带亚热带常绿灌木，原产巴西，在当地的种植历史悠久[1]。嘉宝果叶片中含有大量的黄酮、多酚类植物次级代谢产物，在抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶方面有突出的功效[2]。糖尿病是一种复杂的慢性代谢性疾病，以高血糖和包括糖、脂肪、蛋白质等的三大营养物质的代谢紊乱为特征。持续升高的血糖和血脂引起机体眼部、肾脏、神经系统和血管等多部位功能异常，如视网膜损伤、肾病和中风等并发症[3-4]。氧化应激是糖尿病多种慢性并发症的不同发病机制的共同通路，抗氧化剂可阻断氧化应激损伤途径，在糖尿病的治疗中显现出日益重要的作用[5]。【前人研究进展】从多种植物中提取的抗氧化物质如多酚和黄酮可发挥降血糖作用[6-7]。玫瑰花富含鞣质、原花青素和类黄酮等多酚类化合物，多酚含量可达14.67%[8]，是玫瑰花抗氧化、抗衰老和降血糖等多种功能的主要生理活性物质。Liu 等[9]研究发现，以玫瑰花提取物每日灌胃处理糖尿病大鼠，4 周后，试验组大鼠体重恢复至正常大鼠水平，空腹血糖值、糖耐量和胰岛素抵抗指数显著低于模型组大鼠；此外，在玫瑰花提取物处理下，糖尿病大鼠的血液总胆固醇、甘油三酯和游离脂肪酸水平均有一定下降，表现出良好的降血糖和降血脂功能。柿子叶含有丰富的水溶性多酚，主要以原花青素为主，含量可达2.4%[10]。Jung 等[11]直接将柿子叶干燥粉碎后以5%（w/w）添加到高血糖小鼠的日料中，持续喂养5 周后，试验组小鼠空腹血糖以及血清、肝脏中的TG（甘油三酯）和TC（总胆固醇）显著降低，肝脏脂肪小滴减少，升高的血清指标有HDL-C（高密度脂蛋白-胆固醇）和脂联素，说明柿叶添加能有效降低血糖，改善脂质代谢紊乱，减少肝脏脂质沉着。嘉宝果果皮富含花青素、黄酮等酚类化合物[12]，总多酚含量可达55.63%[13]，将其果皮冻干粉直接添加入高血糖小鼠饮水中饲喂8 周后，发现大鼠血糖最高可降低19%，血浆中的血脂指标如TG、TC、LDL-C（低密度脂蛋白-胆固醇）、VLDL-C（极低密度脂蛋白-胆固醇）等含量均有显著降低，但是对HDL-C 含量影响较小[14]。【本研究切入点】嘉宝果叶片含有丰富的多酚类化合物，总多酚含量可达33.84%[15]，推测嘉宝果叶片也具有体内降糖功效，但其体内降糖活性的相关研究报道极少。【拟解决的关键问题】本研究以静脉注射STZ 的方法建立高血糖小鼠，以含不同添加剂量叶片的饲料饲喂高血糖小鼠，测定血糖及血脂等相关指标评价嘉宝果叶片的降糖作用，为嘉宝果叶片的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试动物：清洁级成年雄性KM 小鼠，体质量（25±1）g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，许可证号：CXK（京）2019-0008。

供试普通饲料：试验动物饲料（饲料代码：1022），由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，饲料生产许可证号：京饲证（2019）06076。

供试嘉宝果叶片：选用沙巴品种嘉宝果的嫩叶，采自福建龙海市惠昌树葡萄专业合作社，随机选取50 株树龄为15 a 的健康植株剪取嫩叶。嫩叶位于枝条顶部，质地柔嫩且叶脉不清晰，颜色嫩绿或淡红。

试验试剂：链脲佐菌素，纯度98%，美国Sigma公司；柠檬酸、柠檬酸钠、蔗糖：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器设备

全自动生化分析仪，iMagic-M7 型，深圳市库贝尔生物科技有限公司；三诺血糖仪，GA-6 型，三诺集团；分析天平，BS110S 型，德国Sartorius 集团；电热鼓风干燥箱，GZX-9246MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；冷冻高速离心机，MIKRO-22R，德国Hettich。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理 将采集的嘉宝果嫩叶于热风干燥箱中60 ℃烘干至恒质量后用粉碎机粉碎40 s（28 000 r·min-1）再过40 目筛，备用。将嘉宝果嫩叶粉末按照不同的添加比例（1%、2%、4%和8%）直接添加入小鼠普通饲料中，制成含有不同嘉宝果嫩叶比例的供试饲料。

1.3.2 动物模型制备 将90 只KM 雄性小鼠适应性喂养7 d 后，随机将小鼠分为正常对照组和糖尿病造模组，其中10 只为正常对照小鼠，剩余80 只作为糖尿病造模用。将正常对照组和造模组小鼠禁食不禁水12 h，造模组小鼠尾静脉一次性注射STZ 造模，剂量为90 mg·kg-1；正常对照组小鼠则尾静脉注射相同量的柠檬酸缓冲液。注射后7 d，各组小鼠禁食不禁水4 h，采用血糖仪以尾静脉针刺采血的方法，检测血糖水平，挑选血糖值在11.1～25.0 mmol·L-1的小鼠为高血糖模型小鼠。

1.3.3 分组及给药 将成模的高血糖小鼠随机分为5 组，每组10 只，包括模型对照组（饲喂普通饲料）、1%叶片添加组（饲喂含有1%嘉宝果叶片的普通饲料）、2%叶片添加组（饲喂含有2%嘉宝果叶片的普通饲料）、4%叶片添加组（饲喂含有4%嘉宝果叶片的普通饲料）、8%叶片添加组（饲喂含有8%嘉宝果叶片的普通饲料），以及正常对照组（饲喂普通饲料），各组小鼠均自由饮水摄食，共饲喂30 d。

1.3.4 生长指标测定 在试验过程中，每日观察动物精神状态、活动情况、毛色光泽度等，并在试验开始、中期及结束时测定各组小鼠体质量。

1.3.5 空腹血糖及血脂指标测定 将各组小鼠禁食不禁水4 h，以尾静脉取血的方法，在试验开始、中期及结束时测定小鼠的空腹血糖。饲喂30 d 后，禁食24 h，小鼠眼眶取血，常温静置40 min 后，于高速冷冻离心机中，12 000 r·min-1，15 min 离心分离上层血清。采用全自动生化分析仪测定TG、TC、HDL-C 和LDL-C 等血脂指标。

1.3.6 血糖曲线下面积检测 于试验结束前，将所有小鼠禁食不禁水4 h 后，正常对照组小鼠依次灌胃蔗糖，剂量为3 g·kg-1，该组第一只小鼠灌胃开始时记为第0 min，并测定第30、120 min 的小鼠血糖值。其余各组小鼠均按照以上方法分别测定。血糖曲线下面积按照《功能食品功能评价原理与动物实验方法》[16]中的公式计算，具体如下：曲线下面积（AUC）=（0 min 血 糖+30 min 血 糖×4+120 min 血糖×3）×0.25。

1.4 数据处理

试验数据采用Microsoft Excel 2007 进行均值计算；采用SPSS 22.0 统计软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 嘉宝果叶片处理对高血糖小鼠生长指标的影响

试验期间，正常对照组小鼠精神状态良好，行动活跃，皮毛光滑，随体质量增加，进食量、饮水量相应增加。模型组小鼠精神状态较差，行动较为迟缓，皮毛较不光滑，光泽度较差，饮水量增加较为明显，体质量降低。饲喂30 d 后，与正常对照组小鼠相比，嘉宝果叶片1%和2%添加组精神状态较差，行动较为迟缓，皮毛较不光滑，光泽度差，饮水量增加明显；4%添加组小鼠精神状态、活动量、皮毛状态较好，饮水量介于正常对照组和2%添加组之间；8%添加组小鼠精神状态良好、行动较活跃、皮毛光滑，饮水量接近正常对照组。与正常对照组比较，模型对照组及嘉宝果叶片处理各组小鼠体质量极显著降低（P＜0.01）；4%和8%添加组小鼠体质量极显著高于模型组（P＜0.01），各组小鼠体质量变化见表1。

2.2 嘉宝果叶片处理对高血糖小鼠空腹血糖的影响

各组小鼠在试验期间的空腹血糖值变化如表2所示。采用尾静脉注射STZ 后，小鼠血糖极显著高于正常对照小鼠（P＜0.01）并高于11.1 mmol·L-1。试验开始前，模型对照组及嘉宝果叶片处理组小鼠血糖值无显著差异（P＞0.05），并全部高于正常对照组（P＜0.01）。饲喂15 d（试验中期）后，与正常对照组小鼠比较，模型对照组及嘉宝果叶片处理组的小鼠空腹血糖值极显著升高（P＜0.01）；与模型对照组比较，8%叶片添加组小鼠的空腹血糖值极显著降低（P＜0.01）。饲喂30 d（试验结束）后，与正常对照组小鼠比较，模型对照组及嘉宝果叶片处理各组的小鼠空腹血糖值仍极显著升高（P＜0.01）；与模型对照组比较，8%叶片添加组小鼠的血糖值继续降低，达（14.99±2.79）mmol·L-1，极显著低于其他叶片处理组和模型对照组（P＜0.01），且低于本组血糖起始值；其余各组小鼠FBG 值在试验期间持续上升，与模型对照组没有差异（P＞0.05）。

表1 嘉宝果叶片对高血糖小鼠体质量的影响Table 1 Effect of jaboticaba leaves in feed on body weight of hypoglycemic mice

表2 嘉宝果叶片对高血糖小鼠空腹血糖的影响Table 2 Effect of jaboticaba leaves in feed on FBG in hyperglycemic mice

2.3 嘉宝果叶片处理对高血糖小鼠糖耐量的影响

各组小鼠糖负荷后血糖值变化如表3 所示。糖负荷后，各组小鼠的血糖值在30 min 内快速升高，在30～120 min 内开始下降。与正常对照组小鼠比较，模型对照组及嘉宝果叶片处理各组的AUC 值极显著升高（P＜0.01）；与模型对照组小鼠比较，1%和2%添加组AUC 值无显著差异（P＞0.05），4%和8%添加组AUC 值极显著降低（P＜0.01），其中8%添加组的降低幅度最大，下降了35.73%；并且该组小鼠120 min 后的血糖值低于初始FBG。

2.4 嘉宝果叶片处理对高血糖小鼠血脂指标的影响

试验期间各组小鼠血脂指标变化情况如表4 所示。饲喂30 d 后，与正常对照组小鼠相比，模型组的TC 和LDL-C 水平没有显著变化，而TG 水平极显著升高（P＜0.01），HDL-C 水平极显著降低（P＜0.01）。与模型组小鼠相比，嘉宝果叶片处理各组的TC 无显著变化；1%和2%叶片添加组的LDLC 水平极显著降低（P＜0.01），4%叶片组小鼠的LDL-C 水平无显著变化，8%叶片组的LDL-C 水平显著升高（ P ＜0.05）；嘉宝果叶片处理各组均可显著降低TG 水平（P＜0.05），1%和2%叶片添加组降至与正常对照组相近的水平；嘉宝果叶片处理各组的HDL-C 水平均极显著上升（P＜0.01），并升至与正常对照组相近的水平。

3 讨论与结论

改善糖尿病患者的高糖高脂状况一直都是糖尿病治疗的重要方向之一。目前糖尿病常用的治疗手段主要为药物干预，包括口服降糖药和注射胰岛素，但长期使用合成药物的患者常见胃肠道不适、皮疹、肝损伤等副作用[17]，而长期使用胰岛素也会引起患者视力下降、体重增加和低血糖等不良反应[18]。因此，寻找安全有效的降糖成分成为降糖药物开发的新方向。本课题组前期研究发现，嘉宝果叶片醇提取物具有良好的抗氧化和体外降糖作用[15]，但未对嘉宝果叶片的体内降糖作用进行研究。

表3 嘉宝果叶片对高血糖小鼠糖耐量的影响Table 3 Effect of jaboticaba leaves in feed on glucose tolerance of hyperglycemic mice

表4 嘉宝果叶片对高血糖小鼠血脂指标的影响Table 4 Effect of jaboticaba leaves in feed on blood lipids in hyperglycemic mice

天然产物在小鼠体内的降糖作用可采用提取物或者植物直接添加的方法进行测定[9,11]，本课题组前期试验发现嘉宝果叶片提取物对高血糖小鼠的降血糖作用较弱，因此，本研究采用直接将嘉宝果叶片添加入小鼠日料中，持续饲喂嘉宝果叶片30 d，并观察各组小鼠的行为变化，测定各组小鼠血糖及血脂相关指标。结果显示，与正常对照组小鼠相比，模型组小鼠出现较为明显的“三多一少”症状，即饮水量增加、进食量增加和体质量减轻。与模型组小鼠相比，嘉宝果叶片处理组小鼠的饮水量、采食量逐渐减少，体质量升高。嘉宝果叶片具有良好的自由基清除能力[2]，可能通过清除体内过多的自由基，减少胰岛β 细胞的损伤，促进葡萄糖的利用，从而缓解高血糖小鼠“三多一少”症状。

对糖尿病患者来说，控制血糖是治疗糖尿病及其并发症的关键。研究表明，控制糖尿病患者的血糖可以预防和延缓糖尿病各种并发症的发生发展[19-20]。本研究中，饲喂含8%叶片饲料的高血糖小鼠的空腹血糖值逐渐下降，到试验结束时，该组空腹血糖浓度下降12.29%，与模型组相比，空腹血糖下降41.01%，优于已报道的白子菜叶片[Gynura divaricata（Linn.）DC.]（34.75%）[21]和 柿 叶（Dispyros kaki Thunb）（24.39%）[22]的降糖效果，说明将嘉宝果叶片添加到小鼠日料中进行饲喂能够有效控制高血糖小鼠的空腹血糖，对糖尿病并发症的预防有积极的作用。糖耐量异常是心血管疾病的危险因子，通过糖负荷试验，可以初步了解胰岛β 细胞的功能以及机体对血糖的调节能力。本研究测定了小鼠糖负荷后2 h 内血糖的AUC 值，结果显示，嘉宝果叶片可改善高血糖小鼠的糖耐量，4%和8%叶片添加组小鼠的AUC 值均显著低于模型组，叶片8%剂量添加组AUC 值比模型组降低了35.73%，超过桑叶（Morus alba L.）（34.91%）[23]和 大 叶 榄 仁 叶（Terminalia catappa L.）（31.98%）[24]降低AUC 值的效果。说明嘉宝果叶片能改善糖负荷，提高机体对血糖的调节能力。

糖脂代谢紊乱是糖尿病患者普遍存在的病理生理变化，是诱发糖尿病患者并发心脑血管疾病的危险要素。本研究对嘉宝果叶片饲喂30 d 后的小鼠血脂指标进行测定，结果显示，TC 及LDL-C 的含量在各组小鼠间差异较小，但TG 及HDL-C 的水平则有较大的差异。嘉宝果叶片1%和2%剂量添加组可极显著降低TG 水平（P＜0.01），且与正常对照组无显著差异（P＞0.01）；各嘉宝果叶片处理组均可升高HDL-C 水平，与正常组无显著差异（P＞0.01）。说明嘉宝果叶片对高血糖小鼠脂质代谢紊乱有一定的调节作用，并以中、低剂量组为佳，这可能是因为高剂量叶片更强地抑制升血脂的靶标物质，引起机体的应激反应，激活了其他可升高血脂的代谢通路。

本研究以STZ 诱导的高血糖小鼠为试验模型，检测小鼠的血糖及血脂等指标，结果表明，嘉宝果叶片能降低高血糖小鼠的空腹血糖，改善糖耐量和脂质代谢紊乱，该试验结果可为今后嘉宝果叶片的开发利用提供一定的参考。

致谢：特别感谢亚热带经济作物研究室张定山同志在本研究的小鼠饲养、日常指标观察过程中给予的帮助。